zum Directory-modus

Tutorial MenueProteinreinigung und -fällungLerneinheit 1 von 2

Proteinreinigung

Der Aufschlusspuffer

Um das optimale Extraktionsmedium zusammenstellen zu können, sind zunächst einige Überlegungen anzustellen:

  • Unter welchen Bedingungen ist ein Protein stabil?
  • Unter welchen Bedingungen wird das Protein möglichst effizient aus dem Gewebe oder der Zelle freigesetzt?

Einige der wichtigsten Faktoren werden im Folgenden näher beschrieben.

Der pH-Wert

In den meisten Fällen wird für die Proteinisolierung ein pH-Wert gewählt, bei dem das Protein seine Aktivität aufweist. Das kann, muss aber nicht der optimale pH-Wert für eine Isolierung sein. Für die Aufreinigung ist vor allem die Stabilität eines Proteins zu berücksichtigen, die möglicherweise bei einem anderen pH-Wert maximal ist. Trypsin zeigt z.B. im pH-Bereich zwischen 8 und 9 seine größte Aktivität, ist aber bei pH 3 erheblich stabiler, da bei diesem pH-Wert die autolytische Aktivität reduziert ist. Für die selektive Extraktion eines Proteins kann es von Vorteil sein, einen extremen pH-Wert zu wählen, der allerdings das gewünschte Protein nicht denaturieren darf.

Der Puffer

Die meisten Proteine sind bei mittlerer Ionenstärke (0,05 bis 0,1 molL-1 ) maximal löslich, und diese Ionenstärke im Puffer reicht aus, wenn auch die Pufferkapazität ausreichend ist. Der Puffer-pH sollte im Bereich von einer pH-Einheit über- und unterhalb des pKa-Wertesliegen. Wie hoch die Pufferkapazität sein muss, hängt vom Ausgangsmaterial ab. Werden bei der Isolierung nur wenige Säuren und Basen frei, kann eine geringe Pufferkapazität ausreichen. Auf jeden Fall sollte der pH-Wert während der Proteinisolierung überprüft werden.

Tab.1
Einige häufig für die Proteinisolierung verwendete Puffersalze
PufferpKa-WerteEigenschaften
Ammoniumacetat4,75 und 9,25flüchtig
Ammoniumbicarbonat6,50; 9,25 und 10,25flüchtig
Natriumacetat4,75-
Natriumbicarbonat6,50 und 10,25-
Natriumcitrat3,09; 4,75 und 5,41bindet Ca2+-Ionen
Natriumphosphat1,5; 7,5 und 12,0-
Tris-Chlorid8,21-
Tris-Phosphat7,5 und 8,21-

Detergenzien oder chaotrope Substanzen

Häufig ist das gewünschte Protein mit Membranlipiden assoziiert oder bildet aufgrund seiner hydrophoben Eigenschaften Aggregate. In diesen Fällen werden Detergenzien oder chaotrope Substanzen bei der Isolierung verwendet. Detergenzien bilden Komplexe mit dem Protein und lassen sich oft nur schwer oder gar nicht aus der Protein-Suspension entfernen. Ab einer gewissen kritischen Konzentration (der CMC oder critical micelle concentration) bilden Detergenzien Micellen, die sich besonders bei der Säulenchromatographie störend auswirken können. Daher sollte bei der Isolation darauf geachtet werden, dass die Detergens-Konzentration unter der CMC bleibt. Einige häufig verwendete Detergenzien sind in der Tabelle aufgeführt.

Reduktionsmittel

Wird eine Isolierung in Gegenwart von Luftsauerstoff durchgeführt, liegt das Redoxpotential des Cytosols unter dem des Isolationsmediums, so dass die Thiol-Gruppen eines Proteins während der Isolierung möglicherweise oxidiert werden. Um diese Thiol-Gruppen zu schützen, werden reduzierende Agenzien wie 1,4-Dithiothreitol (DTT; 1 mmolL-1 ), 1,4-Dithioerythritol (DTE; 1 mmolL-1 ) oder β-Mercaptoethanol (β-ME; 0,1 %ig) zugesetzt.

Chelatoren oder Metall-Ionen

Metall-Ionen können aus zwei Gründen Proteine schädigen: zum einen verstärken sie die Oxdiation von Thiol-Gruppen durch molekularen Sauerstoff, zum anderen können sie mit bestimmten Gruppen des Proteins Komplexe bilden. Bei der Isolierung werden daher oft Chelatoren wie Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EDTA, bindet zweifach positive Ionen) oder Ethylenglycol-bis(2-aminoethyl)-tetraessigsäure (EGTA, hat eine höhere Spezifität für Calcium-Ionen als EDTA) eingesetzt. In anderen Fällen werden aber Metall-Ionen benötigt, um ein Protein stabil in Lösung halten zu können (Calcium, Magnesium), hier muss also auf EDTA verzichtet werden.

Proteolyse-Inhibitoren und andere Zusätze

In fast allen Geweben sind auch Proteasen vorhanden, die die Stabilität eines Proteins im Extrakt drastisch reduzieren können. Wird die Isolierung schnell und in der Kälte durchgeführt, lässt sich der Einfluss der Proteasen zwar reduzieren, sicherheitshalber wird aber oft bei der Isolierung ein Protease-Inhibitor (bzw. ein Mix von Inhibitoren verschiedener Spezifität) zugesetzt. Mitunter lässt sich für die Isolierung auch ein pH-Wert wählen, bei dem das Protein stabil ist, Proteasen aber gehemmt werden.

Um bei längerer Aufbewahrung das Wachstum von Mikroorganismen zu unterbinden, werden in einigen Fällen Bacteriostatika eingesetzt. Protein-Lösungen in physiologischem Puffer sind sehr anfällig für bakterielles oder Pilzwachstum, so dass hier 0,0001 molL-1 Azid, 0,005 % Merthiolat oder Alkohol zugesetzt wird. Azid interagiert allerdings mit Metall-Ionen und kann daher nicht immer verwendet werden; zudem ist diese Substanz sehr toxisch.

Seite 5 von 25