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Tutorial MenueProteinreinigung und -fällungLerneinheit 1 von 2

Proteinreinigung

Der Bradford-Assay

(Bradford 1976)

Der Bradford-Assay ist eine der gebräuchlichsten kolorimetrischen Methoden zur Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Der Test beruht auf einer Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue G-250 an Proteine in saurer Lösung; durch die Bindung wird das Absorptionsmaximum des Farbstoffes von 465 auf 595 nm verschoben. Anhand von Eichkurven lassen sich so Proteinkonzentrationen von wenigen mg in Flüssigkeiten bestimmen. Die Farbreaktion ist abhängig vom Gehalt an aromatischen und an basischen Aminosäuren (z.B. Arginin).

Farbreagenz und Farbreaktion

100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 werden in 100 mL 85 % Phosphorsäure und 50 mL 95 % Ethanol gelöst, dann wird mit deionisierten Wasser auf 1 L aufgefüllt. Um die Farbreaktion zu starten, wird 1 mL Reagenzlösung mit 20 mL Protein-Lösung und 50 mL 1 M NaOH vermischt, für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann die Absorption bei 595 nm bestimmt. Parallel dazu wird eine Eichkurve angesetzt (z.B. mit Ovalbumin). Anhand dieser Kurve lässt sich die Proteinkonzentration der Protein-Lösung ablesen.

Literatur

Bradford, M. M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. In: Anal. Biochem.. 72 , 248-254
Kruger, N. J. (1994): The Bradford method for protein quantitation. In: Methods Mol. Biol.. 32 , 9-15

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