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Tutorial MenueProteinreinigung und -fällungLerneinheit 1 von 2

Proteinreinigung

Die Wahl des Ausgangsmaterials

Bei der Aufreinigung eines Protein sollte eine besonders große Sorgfalt auf die Wahl des richtigen Ausgangsmaterials verwendet werden, um die weitere Aufreinigung möglichst effektiv zu gestalten.

Hinweis
Faktoren wie Verfügbarkeit und Kosten des Ausgangsmaterials, mögliche Probleme beim Umgang mit dem Material oder die Konzentration des Proteins haben einen erheblichen Einfluss auf die Dauer und die Kosten der Aufreinigung!

Oft müssen mehrere verschiedene Reinigungsmethoden nacheinander angewendet werden, um alle anderen Proteine im Ausgangsmaterial zu entfernen, was fast immer mit erheblichen Verlusten an Protein einhergeht. Daher ist es wichtig, ein geeignetes Ausgangsmaterial zu wählen, in dem das gewünschte Protein in ausreichender Menge enthalten ist und das möglichst wenig andere Proteine oder Proteasen enthält.

Hinweis
Eine Aufreinigung sollte immer möglichst zügig bei Temperaturen um 0°C in Puffern mit optimalem pH-Wert und physiologischer Ionenstärke durchgeführt werden, um die Stabilität der Proteine zu erhalten.

Empfindliche Proteine (besonders z.B. Proteine, die durch Luftsauerstoff oxidiert werden können) werden oft während der Isolierungsprozedur denaturiert, wenn nicht besondere Vorkehrungen getroffen werden (Isolierung in der Anaerobierkammer, Zugabe von Reduktionsmitteln, Stabilisatoren etc.). Diese Faktoren müssen häufig erst experimentell bestimmt werden.

Einige biologische Materialien enthalten das gewünschte Protein bereits in einer Lösung, die mehr oder weniger direkt für eine Chromatographie eingesetzt werden kann, wie z.B. Blutserum, Urin, Milch oder der Überstand von Säuger- oder Bakterienzellkulturen. Auch wenn die Proteinkonzentration u. U. in diesen Flüssigkeiten nur gering ist, sind extrazelluläre Proteine oft sehr stabil und die Anzahl kontaminierender Proteine in der Flüssigkeit nur gering.

Andere Proteine müssen hingegen aus Zellen oder Gewebeverbänden isoliert werden. Wichtig ist hier vor allem die Wahl des richtigen Gewebes für den Aufschluss: ein Enzym kann z.B. in einem bestimmten Gewebe in besonders hoher Konzentration vorkommen. Aber dieses ist nicht das einzige Kriterium: Wenn das Enzym nicht ohne Denaturierung aus diesem Gewebe isoliert werden kann, ist es mitunter vorteilhafter, ein anderes Gewebe als Ausgangsmaterial zu wählen. In vielen Fällen lassen sich die Proteine zwar später wieder renaturieren, um aber ein maximal aktives Protein zu erhalten, wird eine Denaturierung bei der Aufreinigung nach Möglichkeit vermieden.

Heterologe Expression in Bakterien oder eukaryontischen Zellen

Abb.1
Eine Bakterienkultur als Expressionsystem für Proteine
Institut für Technische Chemie, Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover

Eine weitere Überlegung ist, ob das Protein wirklich aus dem Ausgangsorganismus isoliert werden soll oder ob eine Expression des entsprechenden Gens in einem anderen Organismus nicht schneller zum Erfolg führen kann. Ein im Darmbakterium E. coli kloniertes und überexprimiertes Protein kann bis zu 40 % des Gesamtproteins der Zelle ausmachen. Es gibt allerdings bei der Klonierung und Expression von regulatorischen Proteinen oder Membranproteinen gelegentlich Probleme, wenn die Überexpression dieser Proteine zum Tod der Bakerienzelle führt. Generell lassen sich aber die meisten cytoplasmatischen Proteine aus bakteriellen Expressionsystemen sehr einfach und in großen Mengen isolieren.

Rekombinante Proteine tendieren allerdings gelegentlich zur Aggregatbildung im Cytoplasma der Bakterienzelle (Einschlusskörper oder inclusion bodies genannt), die sich auch lichtmikroskopisch nachweisen und leicht isolieren lassen. Diese Einschlusskörper bestehen fast nur aus dem rekombinanten Protein und sind kaum mit anderen Protein kontaminiert. Ein Nachteil ist allerdings, dass das Protein denaturiert werden muss, um in Lösung gebracht werden zu können, und eine Rückfaltung nicht immer die Aktivität des Proteins vollständig wiederherstellt.

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