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Tutorial MenueProteinreinigung und -fällungLerneinheit 2 von 2

Fällung von Proteinen

Die Dialyse von Proteinen

Während der Isolierung von Proteinen muss in vielen Fällen ein Pufferaustausch vorgenommen werden, z.B. wenn nach einer Ammoniumsulfat-Fällung das Salz entfernt werden muss (Entsalzen) oder mehrere chromatographische Verfahren mit unterschiedlichen Puffern hintereinander verwendet werden sollen (Umpuffern).

Definition
Bei der Dialyse werden niedermolekulare Stoffe aus der Protein-Lösung entfernt bzw. andere hinzugefügt. Alle Dialysemethoden verwenden semipermeable Membranen, die anorganische Salze und andere niedermolekulare Verbindungen durchtreten lassen, je nach Ausschlussvolumen (cut-off volume) aber von Proteinen nicht passiert werden können.

Übliche Dialysemembranen aus Cellulose haben ein Ausschlussvolumen von etwa 10.000 Da, d.h. dass Proteine mit molekularen Massen über 10.000 Da nur sehr langsam bzw. nur in sehr kleinem Umfang diese Membran passieren können. Das Ausschlussvolumen kann bei Cellulosemembranen zwischen 1 und 50 kDA liegen.

Abb.1
3D-Animation zur Dialyse
© Wiley-VCH

Vor der Verwendung müssen die trockenen Dialyseschläuche zunächst rehydratisiert werden. Dies geschieht durch Kochen in Lösungen, denen häufig 10 mmolL-1 EDTA zugefügt wird, um eventuell vorhandene Schwermetall-Ionen zu komplexieren, bevor sie mehrfach mit destilliertem Wasser nachgespült werden. Wichtig für den Gebrauch ist ferner die Überlegung, ob aufgrund der Konzentration der Protein-Lösung unter Umständen Wasser in den Dialyseschlauch eindringen kann und diesen möglicherweise zum Platzen bringt. Der Schlauch darf also nicht zu prall gefüllt werden. Das Volumen des Dialysepuffers sollte etwa das 200fache der Protein-Lösung betragen, die Dialyse wird üblicherweise im Kühlraum auf einem Magnetrührer durchgeführt. Um den Dialysevorgang zu beschleunigen, sollte der Puffer mehrmals durch frischen Puffer ersetzt werden. Eine Dialyse kann nicht nur zum Entsalzen oder zum Umpuffern verwendet werden, sondern auch zur Konzentrierung einer Probe. In diesem Fall wird die Protein-Lösung gegen eine 10-20 % (w/v) PEG-Lösung (hochmolekulare Form, molekulare Masse ca. 7.500 Da) dialysiert, bis die gewünschte Volumeneinengung erfolgt ist.

Statt eine Probe über Dialyse zu entsalzen oder umzupuffern, kann auch eine Gelfiltration oder eine Ultrafiltration durchgeführt werden. Die Dialyse hat aber den Vorteil, dass sie mit erheblich weniger apparativem und zeitlichem Aufwand durchzuführen ist.

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