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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 1 von 9

Vorbereitung zum gentechnischen Praktikum

Die Herstellung kompetenter Zellen: Calciumchlorid- und Calciumphosphat-Methode

Unter natürlichen Bedingungen sind viele Bakterien in der Lage, genetisches Material aus ihrer Umgebung aufzunehmen - allerdings mit geringer Effizienz. In der Molekularbiologie wurden verschiedene Verfahren entwickelt, die die Permeabilität der Zellmembranen kurzzeitig erhöhen und damit die Effizienz der DNA-Aufnahme steigern. Für Gram-negative Zellen wie E. coli sind dieses vor allem Methoden wie die Elektroporation und die Herstellung so genannter kompetenter Zellen. Der Begriff "Kompetenz" bedeutet in diesem Zusammenhang die Fähigkeit von Zellen, DNA aufnehmen, d.h. transformiert werden zu können.

Die Calciumchlorid-Methode

Abb.1
Calciumchlorid-Lösung

Für das Bakterium E. coli wird in den meisten Fällen die Calciumchlorid-Methode verwendet, um kompetente Zellen zu erzeugen. Die Wirtszellen werden bei diesem Verfahren mit 0,1 molarer Calciumchlorid-Lösung behandelt. Ein Überschuss an Calcium-Ionen verändert die Durchlässigkeit der Membran und steigert die Aufnahmefähigkeit der Zellen für Fremd-DNA, der Mechanismus dieses Phänomens ist allerdings noch nicht geklärt.

Die kompetenten Zellen können in großem Maßstab hergestellt und bei -70 °C für drei bis vier Monate gelagert werden, ohne an Kompetenz zu verlieren. Bei der späteren Transformation wird eine optimale Aufnahme der DNA erzielt, wenn die kompetenten Zellen einer Kälte-Wärme-Behandlung (Hitzeschock, z.B. 3 min bei 42 °C oder 10 min bei 37 °C) unterzogen werden. Trägt die rekombinante DNA ein Resistenzgen als Marker, so werden die transformierten Zellen zunächst in einfaches Nährmedium (z.B. LB-Medium) überführt, um die Expression des Resistenzgens zu gewährleisten, bevor die Kultur in das Selektivmedium überführt werden kann.

Mit Hilfe dieser Technik können bis zu 105-109 Primärtransformanden pro µg DNA erzeugt werden.

Abb.2
Kompetente Zellen

Die Herstellung kompetenter Zellen

Die Calciumphosphat-Methode

Die Calciumphosphat-Methode wird bei der Transfektion eingesetzt.

Die DNA wird bei dieser Technik mit Calciumchlorid und einer phosphathaltigen Pufferlösung gemischt. Dabei kommt es zu einer Ausbildung feiner DNA-Calciumphosphat-Kristalle, die sich, wenn sie mit den Zellen in Kontakt kommen, auf der Zelloberfläche niederschlagen. Über Endocytose wird dann die Aufnahme der DNA in die Zelle vermittelt. Auch dieser Mechanismus ist weitgehend ungeklärt.

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