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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 5 von 9

Praktikum 2: Restriktionskartierung

Bedeutung der Restriktionsendonucleasen

Mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen können in vitro gezielt DNA-Abschnitte aus dem Kontext riesiger Genome herausgeschnitten und isoliert werden. Auf dieser Eigenschaft beruht die enorme Bedeutung der Restriktionsenzyme für die Entwicklung der Gentechnologie.

Abb.1
Die Restriktionsenzyme Pstl und BamHl

1. Die Restriktionskartierung

Bevor in praktisch jedem Labor Sequenzierautomaten verfügbar waren, die ein Plasmid in kurzer Zeit sequenzieren können, stand am Anfang der Charakterisierung unbekannter Plasmide oft die Anfertigung einer Restriktionskarte. Bei diesem Verfahren werden die Schnittstellen einer Reihe ausgewählter Restriktionsendonucleasen auf dem Plasmid durch Ein- oder Mehrfachspaltungen kartiert. Auch heute ist die Restriktionskartierung noch eine schnelle, einfache Methode, um z.B. die Orientierung eines einklonierten Fragmentes zu überprüfen.

2. Die Klonierung

Auch für die Klonierung von DNA-Abschnitten sind die Restriktionsendonucleasen essenzielle Werkzeuge. Die komplementären, einzelsträngigen Enden (sticky ends) von DNA-Restriktionsfragmenten können miteinander Basenpaarungen eingehen, die dann in vitro durch die Ligase miteinander verknüpft werden können. Bei Restriktionsfragmenten mit blunt ends ist eine Zusammenlagerung ebenfalls möglich, jedoch deutlich weniger effektiv. Auf diese Weise können DNA-Fragmente unterschiedlicher Herkunft zu neuen DNA-Molekülen verbunden werden.

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