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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 5 von 9

Praktikum 2: Restriktionskartierung

Versuchsdurchführung: Restriktionskartierung

In diesem Versuch werden insgesamt fünf Restriktionsenzyme jeweils einzeln und in allen Zweierkombinationen eingesetzt, um das Plasmid zu charakterisieren. Alle Spaltungen können im NEB-Enzympuffer 3 (New England Biolabs) durchgeführt werden, da laut Herstellerangaben die Enzyme PstI, EcoRI, EcoRV und PvuII in diesem Puffer zu 100 % aktiv sind. Die Aktivität von BamHI beträgt lediglich 50 %, was unter den gegebenen Umständen aber tolerierbar ist. Die Spaltungsansätze folgen dem angegebenen Schema.

Tab.1
Spaltungsansatz Einzelspaltungen (Gesamtvolumen 20 µl)
MengeZusatz
12 µl bidest. H2O
2 µl 10 x Enzympuffer (Endkonzentration 1 x)
5 µl Plasmid-DNA aus eigenem Minilysat
1 µl Restriktionsenzym (auf Eis!)
Tab.2
Spaltungsansatz Doppelspaltungen (Gesamtvolumen 20 µl)
MengeZusatz
11 µl bidest. H2O
2 µl 10 x Enzympuffer (Endkonzentration 1x)
5 µl Plasmid-DNA aus eigenem Minilysat
1 µl je Restriktionsenzym (auf Eis!)

Anschließend werden alle Ansätze für circa 1,5 h bei 37 °C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Ansätze mit Laufpuffer vesetzt und auf ein Agarose-Gel aufgetragen (Details siehe Gelelektrophorese).

Die Aufgabe: Bitte fertigen Sie eine Tabelle an, aus der die im Vergleich zum Standard berechneten Fragmentgrößen eingetragen sind, und erstellen Sie daraus eine Restriktionskarte Ihres Plasmids!

Chemikalienliste

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