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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 7 von 9

Praktikum 4: Ligation und Transformation

Die Restriktionsanalyse

Nicht nur die Temperatur der Ligase-Reaktion, sondern auch Parameter wie Vektor- und Insertkonzentration oder die generellen Bedingungen der Reaktion haben einen erheblichen Einfluss auf das Ergebnis. Ist der Vektor beispielsweise nur mit einem Enzym linearisiert, aber nicht durch Phosphatase-Behandlung am 5'-Ende dephosphoryliert worden, wird er mit hoher Wahrscheinlichkeit bevorzugt wieder ohne Einbau des DNA-Fragmentes religieren.

Abb.1

(1) Beispiel eines Ligase-Ansatzes mit wenig Aussicht auf Erfolg. Der Vektor trägt beide 5'-Phosphate und lagert sich in einer intramolekularen Reaktion bevorzugt mit sich selbst zusammen. Die Ligase erkennt dieses Addukt als Substrat, so dass am Ende sehr viel leerer Vektor gebildet wird und nur wenig gewünschtes Produkt (zur Vergrößerung bitte das Bild anklicken).

Abb.2

(2) Ähnlicher Ligationsansatz wie bei (1), aber diesmal mit dephosphoryliertem Vektor. Die Vektor-Selbstligation ist aufgrund der fehlenden 5'-Phosphat-Enden unterbunden und es entstehen fast ausschließlich Plasmide mit Fremd-DNA, die das Insert in beiden Orientierungen erhalten können (zur Vergrößerung bitte das Bild anklicken).

Nach der Ligation eines Vektors mit einem Insert ist die Analyse der Produkte besonders im Hinblick auf die weitere Verwendung der rekombinanten DNA wichtig, denn falls das Insert in der falschen Orientierung vorliegt, wird eine Expression der klonierten Gene u.U. unmöglich. Unter einer Restriktionsanalyse versteht man die Charakterisierung einer DNA durch gezielte Spaltung in Fragmente definierter Größe unter Einsatz von Restriktionsendonucleasen. Die rekombinatinaten Plasmide lassen sich durch folgende vier Spaltungen analysieren:

  • Linearisierung. Das Plasmid wird mit einem Enzym gespalten, das eine singuläre Schnittstelle auf dem Plasmid besitzt. Diese Analyse dient der Bestimmung der Gesamtlänge des Plasmids.
  • Rückspaltung. Die Rückspaltung erfolgt mit den Enzymen, die auch bei der Klonierung eingesetzt wurden. Eine Freisetzung des bei der Ligation eingebauten Inserts beweist korrekte Klonierungsgrenzen. Aber Achtung: es gibt auch Kombinationen von Restriktionsenzymen, bei denen die ursprünglichen Schnittstellen nach der Ligation verloren sind!
  • Umgreifende Spaltung. Die umgreifende Spaltung ermöglicht die Größenbestimmung des eingebauten Inserts. Sie erlaubt weiterhin den Ausschluss einer Mehrfachinsertion und wird deshalb mit Hilfe zweier Restriktionsschnittstellen durchgeführt, die möglichst in der Nähe, aber nicht innerhalb des jeweiligen Inserts liegen.
  • Orientierende Spaltung. Die orientierende Spaltung wird erforderlich, wenn das eingebaute Insert zwei identische Enden trägt und dadurch der Einbau in beiden Orientierungen erfolgen kann. Man analysiert dies durch Spaltung mit zwei Enzymen, wobei das eine in der Nähe einer der beiden Klonierungsschnittstellen auf dem Vektor und das andere asymmetrisch auf dem Insert schneiden sollte.
Tab.1
Analyse der Ligationsprodukte
Mögliche Konstellationen des LigationsproduktesUrsacheSinnvolle Restriktionsanalyse
Mehrfachinsertionunerwünschter Mehrfacheinbau des Inserts, z.B. bei zu hoher InsertkonzentrationLinearisierung, Rückspaltung und umgreifende Spaltung
Orientierung des Insertsbei einer Restriktion mit nur einem Enzym kann der Einbau des Inserts im gewünschten Leserahmen oder entgegengesetzt erfolgt seinorientierende Spaltung
leerer VektorReligation des Vektors ohne Insert, die bei einer Restriktion mit nur einem Enzym ohne Phosphatase-Behandlung häufig vorkommtLinearisierung
DeletionVerlust einiger Insert-Sequenzbereiche als Folge einer Unverträglichkeitsreaktion der Zelle (z.B. bei der Klonierung von Membranproteinen in high copy-Vektoren)Linearisierung und Rückspaltung (eindeutige Aussagen sind bei sehr kleinen Deletionen nur anhand der DNA-Sequenzierung möglich)
Abb.3
DNA-Ligase-Puffer
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