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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 7 von 9

Praktikum 4: Ligation und Transformation

Arbeitsprotokoll: Transformation von E. coli

Abb.1
Gefrierkultur
Institut für Technische Chemie, Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover

Von einer frischen E. coli-Übernachtkultur werden kompetente Zellen nach dem Protokoll Herstellung von kompetenten Zellen hergestellt und bis zur weiteren Verwendung für die Transformation im Eis aufbewahrt.

Alternativ können auch bei -70 °C eingefrorene kompetente Zellen eingesetzt werden, die vorsichtig auf Eis aufgetaut werden. Durch Zusatz von Glycerol (4 mL Zellen, 1 mL 75 %iges Glycerol) und Einfrieren in flüssigem Stickstoff lassen sich kompetente Zellen mehrere Wochen lang lagern. Die Effizienz, mit der diese gelagerten Zellen DNA aufnehmen können, sinkt dabei allerdings mit der Zeit.

Die Ligase-Reaktion

Zwei Ligase-Reaktionen und eine Kontrollreaktion werden wie folgt angesetzt:

Tab.1
Ligase-Ansatz (Gesamtvolumen jeweils 20 µL; zwei Ansätze)
MengeZusatz
2 µLVektor-DNA: pHK255 - 2.516 bp EcoRI- BgII
3 µLInsert-DNA: pHK255 - 1.237 bp EcoRI- BgII
2 µLLigase-Puffer, 10x (500 mM Tris pH 7,6; 100 mM MgCl2 ; 10 mM DTT, 10 mM ATP, 5 % PEG-5000)
12 µLbidest. Wasser
Tab.2
Kontrollansatz ohne Insert-DNA (Gesamtansatz 20 µL)
MengeZusatz
2 µLVektor-DNA pHK255
2 µLLigase-Puffer, 10x (500 mM Tris pH 7,6; 100 mM MgCl2 ; 10 mM DTT, 10 mM ATP, 5 % PEG-5000)
15 µLbidest. Wasser

Die Ansätze werden gründlich gemischt, jeweils mit 1 µL T4 DNA-Ligase versetzt und für ca. 3 h unter folgenden Bedingungen inkubiert:

  • Ligase-Ansatz 1: 4 °C Kühlschrank
  • Ligase-Ansatz 2: 16 °C Wasserbad, Kältelabor
  • Ligase-Ansatz 3: Kontrolle, 37 °C Wasserbad, Praktikum

Transformation von E. coli mit den Ligase-Ansätzen

Zu je 100 µL kompetenten Zellen werden 20 µL der Ligase-Gemische gegeben. Außerdem werden zwei Kontrolltransformationen angesetzt: 100 µL kompetente Zellen + 1 µL bidest. Wasser (negative Kontrolle zur Bestimmung der Spontanresistenzrate) bzw. 100 µL kompetente Zellen + 1 µL ringförmiger pHK255 DNA (positive Kontrolle zur Bestimmung der Qualität der kompetenten Zellen) versetzt. Alle sechs Ansätze werden vorsichtig gemischt, verbleiben 15 min auf Eis, dann 5 min bei 37 °C, erneut 10 min auf Eis, 5 min bei 37 °C und nochmals 15 min auf Eis. Durch diese schonende Wärme/Kältebehandlung kann die DNA im Ligationsansatz in die Zellen aufgenommen werden.

Vier Kulturröhrchen werden mit je 0,5 mL LB-Medium gefüllt (RT). Die vier Transformationsgemische werden nach Abschluss der Wärme/Kältebehandlung möglichst quantitativ in das vorbereitete LB-Medium gegeben, das dann für 45 min bei 37 °C im Schüttelinkubator gehalten wird. Durch das Verdünnen der Calciumchlorid-Lösung mit Medium können sich die Membranen nun wieder schließen. Im Anschluss an diese Regenerationsphase werden 50 µL, 100 µL und 200 µL des Transformationsansatzes auf Ampicillin-haltigen Agarplatten ausplattiert; entsprechend wird mit der positiven Kontrolle verfahren. Die Zellen der negativen Kontrolle werden abzentrifugiert, im Rücklauf resuspendiert und vollständig auf eine Agarplatte gegeben.

Die Platten werden über Nacht bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.

Chemikalienliste

Auswertung der Transformation

Abb.2
Einzelkolonien

Durch Auszählen der Kolonien auf einer Platte lässt sich unter die Anzahl transformierter Zellen pro ml bestimmen. Die positive Kontrolle gibt einen Hinweis darauf, wie effizient die DNA-Aufnahme der kompetenten Bakterien war, die in diesem Versuch verwendet wurden - ein Punkt, der besonders dann wichtig ist, wenn bereits lange gelagerte kompetente Zellen verwendet werden. Ein Vergleich der Transformation des Ligase-Ansatzes mit der positiven Kontrolle erlaubt Rückschlüsse auf die Versuchsbedingungen der Ligation, wie z.B. das Vektor/Insert-Verhältnis oder die Effizienz der Ligase-Behandlung.

Die negative Kontrolle zeigt hingegen an, ob das Antibiotikum wirksam ist und ob spontane Resistenzen auftreten. Im Idealfall sollte die Agarplatte der negativen Kontrolle frei von Kolonien sein.

Die Analyse der Plasmide

Von jeder Platte werden zwei Kolonien zufällig ausgewählt und in 2 mL LB-Medium abgeimpft. Diese Kulturen werden über Nacht bei 37 °C im Schüttler inkubiert. Die Plasmid-DNA dieser Klone wird am nächsten Tag mit der Minilysat-Methode isoliert (siehe Plasmid-DNA-Isolierung)

Die Charakterisierung der Plasmide (Ligase-Produkte) schließt immer drei Spaltungen ein: Rückspaltung, umgreifende und orientierende Spaltung. Die DNA aus den sechs Kolonien wird mit EcoRI und BglI jeweils einzeln und gemeinsam zurückgespalten, d.h. die Ausgangsschnitte werden auf korrekte Regenerierung überprüft. Um sicher zu gehen, dass das Insert nur einmal in den Vektor einligiert wurde, wird das Enzym BstEII eingesetzt, das eine Linearisierung des Vektoranteils erlaubt. Eine orientierende Spaltung kann hier entfallen, da mit zwei verschiedenen Enden gearbeitet wurde.

Es stehen also drei Enzyme zur Verfügung: EcoRI und BglI bei 37 °C; BstEII bei 60 °C.

Entsprechend der unten angegebenen Hilfstabelle zur Charakterisierung von pHK255 werden für vier Spaltungsansätze (drei Einzel- und eine Doppelspaltung) Reaktionsgefäße mit dem Namen des Plasmids und der Restriktionsenzyme versehen. Dabei sollen auch die Kontrolle und der Standard berücksichtigt werden.

Tab.3
Spaltungsansatz (Gesamtvolumen 20 µL):
MengeAnsatz
12 µL bidest. H2O
2 µL 10 x NE-Puffer 3 (im Gesamtvolumen also 1 x)
5 µL Plasmid-DNA aus eigenem Minilysat
1 µL je Restriktionsenzym

Anschließend wird für ca. 1,5 h bei 37 °C bzw. bei 60 °C, gefolgt von 5 min bei 60 °C inkubiert. Die Hitzeinaktivierung des Enzyms kann bei BstEII entfallen.

Vor der Agarose-Gelelektrophorese weden je 4 µL Ladepuffer zu den Ansätzen gegeben und der Ansatz in die Geltasche pipettiert.

Hilfstabelle zur Charakterisierung von pHK255

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