zum Directory-modus

Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 9 von 9

Praktikum 6: LacZ-Test

Induktion und Repression

Der bakterielle Stoffwechsel muss oft an eine sich schnell verändernde Umwelt angepasst werden, wenn beispielsweise ein neues verwertbares Substrat verfügbar ist oder eine bisher genutzte Futterquelle versiegt. Dieses erfordert eine präzise Anpassung der Proteinbiosynthese, die hauptsächlich auf der Transkriptionsebene, d.h. über die Induktion oder die Repression der Genexpression, koordiniert reguliert wird.

Als Vermittler zwischen Umwelt und Proteinbiosynthese fungieren regulatorische Proteine, die an DNA-Bereiche in der Nachbarschaft eines Gens oder Operons binden und die Bindungseigenschaften der RNA-Polymerase beeinflussen. Der Promotor ist eine Basensequenz, die von der RNA-Polymerase erkannt und gebunden wird; hier beginnt die Transkription. Der Operator ist eine Basensequenz, die zwischen Promotor und den Strukturgenen liegt und die einen Repressor binden kann. Wenn ein Repressor an den Operatorbereich bindet, wird die Transkription durch die RNA-Polymerase verhindert. Ein Induktor kann wiederum die Konformation des Repressors verändern, so dass dieser nicht mehr bindet und den Operatorbereich verlässt. Die Regulation über Induktion und Repression lässt sich gut am Beispiel des lac-Operons demonstrieren.

Abb.1
Animation zum lac-Operon
© Wiley-VCH

Das lac-Operon ist für den Lactose-Abbau des Zuckers Lactose in E. coli verantwortlich. Das Disaccharid Lactose wird durch die Permease (LacY) aufgenommen und von der β-Galactosidase (LacZ) gespalten, während die Transacetylase (LacA) am Abbau verwandter Zuckerverbindungen beteiligt ist. Wenn keine Lactose in der Umgebung des Bakteriums vorhanden ist, wird das lac-Operon durch den Repressor LacI reprimiert. In Gegenwart von Lactose wird das lac-Operon dereprimiert, es sei denn, dass gleichzeitig Glucose verfügbar ist. In diesem Fall wird erst die Glucose abgebaut, bevor die Proteine für den Lactose-Abbau synthetisiert werden.

P=Promotor, O=Operator, schwarz: Terminationssignal. Strukturgene: lacZ (β-Galactosidase), lacY (Permease), lacA (Transacetylase) und lacI (Lac-Repressor).

Mehr zur Regulation des lac-Operons

Anwendung des lac-Operons in der Molekularbiologie

Auf Komponenten des lac-Operons basierende Systeme werden schon seit vielen Jahren in der Molekularbiologie für verschiedene Fragestellungen eingesetzt: Für die Expression von Proteinen werden häufig Expressionsvektoren verwendet, deren Kontrollelemente aus dem lac-Operon stammen.

Das lacZ-Gen selbst wird oft als Reportergen verwendet, um die Aktivität eines Promotors zu testen. Die β-Galactosidase spaltet neben dem natürlichen Substrat Lactose auch Farbsubstrate wie X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranosid; das Produkt ist blau gefärbt) oder ONPG (ortho-Nitrophenyl-galactosid). Das farblose ONPG wird enzymatisch in das intensiv gelb gefärbte ortho-Nitrophenol umgewandelt, dessen Konzentration photometrisch bestimmt werden kann. Die Menge des gebildeten Farbstoffs ist von der β-Galactosidase-Konzentration abhängig und lässt im Vergleich mit einem Standard Rückschlüsse auf die Aktivität eines unbekannten Promotors zu.

Abb.2
β-Lactose
Abb.3
X-gal
Abb.4
ONPG
<Seite 1 von 6