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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 3 von 9

Praktikum 1.1.: Fragmentisolierung aus dem Gel

Versuchsdurchführung: Fragmentisolierung aus dem Gel

In diesem Versuch soll ein EcoRI/BglI-Fragment eines Plasmids aus dem Agarose-Gel isoliert und aufgereinigt werden, um dieses Fragment später in einen anderen Vektor klonieren zu können. Dazu wird zunächst das Ausgangsplasmid aus E. coli isoliert und mit Hilfe eines kleinen, schnellen Agarose-Gels (Minigels) die Ausbeute an Plasmid-DNA bestimmt.

1. Spaltung des Ausgangsplasmids mit Restriktionsenzymen

Die Plasmid-DNA wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BglI und geeignetem Spaltungspuffer (NEB-Puffer 3, New England Bio Labs) versetzt und für 3 h bei 37 °C inkubiert. Etwa 3 % des Ansatzes werden auf ein 1 %iges Minigel aufgetragen, um den Erfolg der Spaltung zu kontrollieren.

2. Die präparative Gelelektrophorese

Das vollständig gespaltene Ausgangsplasmid wird 1:1 verdünnt, mit Ladepuffer versetzt und auf ein präparatives 1 %iges Agarose-Gel in TBE-Puffer aufgetragen. Die mit Ethidiumbromid angefärbten Banden werden nach dem Lauf möglichst präzise ausgeschnitten, die Gelblöcke dann in sehr kleine Stückchen geschnitten und in ein oder mehrere (vorgewogene!) Eppendorfgefäße überführt. Nun wird das Gewicht der Gelblöcke bestimmt, wobei das Gewicht der einzelnen Stücke 400 mg nicht übersteigen sollte. Die anschließende Isolierung folgt dem so genannten "QIAquick Gel Extraction-Protokoll" (Qiagen).

3. Aufreinigung der DNA mit dem "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen)

Pro 100 mg Gel werden 300 µl QG-Puffer zugegeben und für 10 min bei 50 °C oder ggf. auch länger inkubiert, bis dass die Gelblöcke vollständig verflüssigt sind. Der Prozess kann durch regelmäßiges Durchmischen erleichtert werden.

Hinweis
Des Ansatzes sollte zu diesem Zeitpunkt gelb gefärbt sein, denn der QG-Puffer enthält einen pH-Indikator. Falls die Lösung einen orangefarbenen oder violetten Farbton aufweist, sind 10 µl 3 M Natriumacetat (NaOAc), pH 5,0 zuzugeben, um den für die Bindung der DNA an die Säulen optimalen pH-Wert von ca. 7,5 zu erreichen.

Der Ansatz wird über eine kommerziell erhältliche Anionenaustauscher-Säule (spin column) gegeben und ein Vakuum angelegt, bis sich die Lösung im Säulenreservoir befindet. Bei diesem Schritt bindet die DNA an das Säulenmaterial, während die Lösung mit Hilfe des Vakuums schnell abgezogen wird. Wahlweise kann die Säule auch auf ein Eppendorfgefäß gesetzt und für 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert werden.

Nun folgt ein Waschschritt: Der Auftragspuffer wird verworfen, 750 µl PE-Puffer auf die Säule gegeben und erneut unter Vakuum abgesaugt (wahlweise kann die Säule auch auf ein Eppendorfgefäß gesetzt und für 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert werden). Um noch die letzten Reste von PE-Puffer zu entfernen, wird die Säule auf ein neues Eppendorfgefäß gesetzt und für 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.

Im letzten Schritt wird die gereinigte DNA von der Säule gelöst. Die Säule wieder auf ein neues, steriles Eppendorfgefäß gesetzt und 30 µl bidest. Wasser in die Mitte der Säule pipettiert. Nun wird nochmals für 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Durchlauf enthält die gereinigte Fragment-DNA.

Chemikalienliste

Puffer

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