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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 2 von 9

Praktikum 1: DNA-Isolierung

Durchführung einer Agarose-Gelelektrophorese

Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit 0,8-12 kb Größe werden üblicherweise 0,8 %ige Agarose-Gele verwendet. Wie auf der Seite Herstellung einer Agaroselösung beschrieben, wird dazu Agarose in einem Erlenmeyer-Kolben eingewogen, mit Elektrophorese-Puffer aufgefüllt, aufgekocht und auf etwa 50 °C abgekühlt, bevor die Lösung in den vorbereiteten Gelträger gegossen werden kann. Nach dem Erstarren des Gels wird der Kamm entfernt.

Abb.1
Entfernung des PVC-Kammes

Vorbereitung des Gels

Vor der Gelelektrophorese werden beide Seiten der Elektrophoresekammer mit dem entsprechenden Elektrophorese-Puffer (TBE- oder TAE-Puffer) gefüllt, bevor das fertige Agarose-Gel im gleichen Puffer eingesetzt und der Probenkamm entfernt werden kann. Der Puffer sollte die Geltaschen komplett füllen und das Gel gerade bedecken. Achtung: Das Gel muss korrekt in der Kammer positioniert sein, so dass die Proben durch das Gel zur Anode wandern!

Abb.2
Gelelektrophorese-Apparatur

Vorbereitung der Proben

Die DNA wird vor der Gelelektrophorese in einem Verhältnis von ca. 5:1 mit Laufpuffer versetzt. Dieser Puffer enthält Glycerol und erhöht die Dichte der DNA-Lösung, so dass die Probe in die Geltasche sinkt und nicht herausgespült wird. Zudem ist ein Farbmarker, üblicherweise Bromphenolblau und/oder Xylencyanol im Ladepuffer enthalten, mit dem der Verlauf der Elektrophorese kontrolliert werden kann. Bromphenolblau wandert im Agarose-Gel parallel zur DNA mit einer Größe von ca. 450 bp, so dass die Gelelektrophorese rechtzeitig beendet werden kann, bevor die kleinen Fragmente aus dem Gel in den Laufpuffer übertreten. Um später die Größe der DNA-Fragmente bestimmen zu können, wird ein DNA-Größenstandard wie beispielsweise mit HindIII oder HindIII/EcoRI-verdaute λ-DNA verwendet.

Der Gellauf

Sobald alle Proben in die Geltaschen pipettiert wurden, kann Spannung angelegt werden, die üblicherweise 5 V/cm betragen sollte. Bei großen Probenvolumina (20 µl) lässt sich die Schärfe der Banden erhöhen, wenn zunächst nur eine Spannung von 1 V/cm angelegt wird, bis die Proben aus der Geltasche ins Gel gewandert sind. Das Gel darf sich während der Elektrophorese nicht erwärmen oder sogar schmelzen; in diesem Fall ist die angelegte Spannung zu hoch oder der Laufpuffer muss erneuert werden.

Nach der Beendigung des Gellaufs wird das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt, damit die DNA anschließend unter UV-Licht bei 254 nm sichtbar gemacht werden kann. Die Gele können nun fotografiert und als Papierkopie oder in digitaler Form ausgewertet werden.

Hinweis
Eine hohe Salzkonzentration in der DNA-Probe behindert die Wanderung der DNA im Gel und führt u.U. zu einer ungleichmäßigen Lauffront, die die spätere Auswertung des Gels erschwert. Enthält die DNA noch Reste von Ethanol, lässt sich sich die Probe nicht in die Geltasche pipettieren und wird gleich wieder hochgespült.

Puffer und Lösungen für die Gelelektrophorese

λ-Standard

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