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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 2 von 9

Praktikum 1: DNA-Isolierung

Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit von Nucleinsäuren

Die Konzentration einer DNA- oder RNA-Lösung wird im Labor üblicherweise photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm in einer Quarzkürvette bestimmt. Aus der Extinktion der Lösung kann die Konzentration anhand des folgenden Verhältnisses berechnet werden:

OD260 = 1 entspricht 50 µg/mL doppelsträngiger (ds) DNA, 40 µg/mL RNA, 33 µg/mL einzelträngiger DNA und etwa 20 µg/mL bei Oligonucleotiden. Dieses gilt für Nucleinsäuren bei pH 7,0; die Messung sollte daher in einem Puffer mit geringer Salzkonzentration (z.B. ein Tris1)-Puffer mit pH 7,0) durchgeführt werden.

Kontamination der Nucleinsäure-Lösung

Je nach verwendeter DNA-Isolierungsmethode können Nucleinsäure-Lösungen mit RNA, Proteinen oder auch Resten von Phenol kontaminiert sein. Während sich eine Kontamination mit RNA oder Phenol (Absorptionsmaximum bei 270-275 nm) spektrometrisch nicht nachweisen lässt, gibt das Verhältnis der Nucleinsäure-Absorption zur Protein-Absorption Auskunft über die Reinheit einer Nucleinsäure-Lösung.

Das Absorptionsmaximum für Proteine liegt, basierend auf der Absorption der aromatischen Aminosäurereste, bei 280 nm. Das Verhältnis der OD260 zur OD280 zeigt an, wie stark eine DNA-Lösung noch durch Alkohol und Reste von Proteinen verunreinigt ist. Ein Verhältnis von 1,8 spricht für eine reine DNA-Isolierung, ein Verhältnis von 2,0 für eine reine RNA-Isolierung. Ist die Nucleinsäure-Lösung mit Proteinen oder Phenol kontaminiert, so ist der Wert signifikant kleiner. Oft wird auch der Quotient OD230 zur OD260 bestimmt, der im Idealfall bei 0,45 liegen sollte und ein Indikator für weitere Verunreinigungen z.B. mit Polysacchariden ist.

Arbeitsprotokoll: Bestimmung der DNA-Konzentration

TE-Puffer

Andere Verfahren

Zur Bestimmung des DNA-Gehalts einer mit RNA kontaminierten Probe ist die spektrometrische Analyse nicht geeignet. In diesen Fälle kann die Nucleinsäure-Probe im Agarose-Gel zusammen mit einer Vergleichsprobe möglichst ähnlicher Größe getrennt und das Gel nach Beendigung des Laufs mit Ethidiumbromid gefärbt werden. Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und fluoresziert, wenn es mit UV-Licht bestrahlt wird. Durch die Messung der Fluoreszenz mit Scanner- oder Imaging-Systemen lässt sich die DNA-Konzentration nun quantifizieren.

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