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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 2 von 9

Praktikum 1: DNA-Isolierung

Elektrophoretische Auftrennung von Plasmid-DNA

Lineare DNA wandert im Agarose-Gel immer gleich, so dass sich aus dem Vergleich mit einer im gleichen Gel aufgetrennten Standardprobe die Größe eines DNA-Fragmentes berechnen lässt. Für die gelelektrophoretische Auftrennung von Plasmid-DNA gilt das nicht. Wird Plasmid-DNA aus einem Bakterium isoliert und im Agarose-Gel aufgetrennt, treten oft mehrere Banden auf, die sich nicht mit der linearen Größenstandard-DNA vergleichen lassen und oft schwer zu interpretieren sind.

Dieses Phänomen beruht auf der unterschiedlichen Konformation der Moleküle: Plasmide können linearisiert sein, einen Einzelstrangbruch aufweisen (nicked circled DNA, entspannt zirkuläre Form) oder in der üblichen superspiralisierten Form (supercoiled DNA) vorliegen. Superspiralisierte DNA kleiner und mittelgroßer Plasmide ist, basierend auf ihre Topologie, wesentlich kompakter und starrer als lineare oder entspannte zirkuläre DNA und wandert daher im elektrischen Feld deutlich schneller als gleich große lineare oder entspannt zirkuläre DNA. Ab einer Größe von etwa 50 kb dreht sich das Wanderungsverhalten von superspiralisierter und entspannt zirkulärer DNA allerdings um, so dass nun die superspiralisierte Form der DNA langsamer läuft. Mitunter ist das Bild noch komplexer, wenn multimere Übergangszustände der Plasmide isoliert wurden, wie es bei manchen E. coli-Wirtsstämmen häufiger auftritt - in diesen Fällen zeigt das Agarose-Gel regelrecht eine Strickleiter verschiedener Plasmid-Formen.

Abb.1
Gelelektrophorese mit Plasmid-DNA
Abb.2
Agarose-Gel einer Plasmidisolierung
Foto freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Frau Dr. Dreiseikelmann, Universität Bielefeld

Spur 1: λ-DNA EcoRI/HindIII als Marker, Spur 2: 3 kb-Plasmid in der ccc1)-Form, Spur 3: das gleiche Plasmid linearisiert, Spur 4: Plasmid mit 1,3 kb-Insert in der ccc-Form, Spur 5: Insert herausgespalten. In Spur 2 (3 kb-Plasmid) und Spur 4 (4.3 kb-Plasmid) ist jeweils die entspannt zirkuläre DNA oberhalb der superspiralisierten Form der DNA zu sehen.

Hinweis
Die relative Reihenfolge der verschiedenen Plasmid-Konformationen ist u.a. abhängig von der Molekülgröße und dem Puffersystem bzw. der Ionenzusammensetzung des Gels.
Um also Plasmid-DNA unterschiedlicher Größe eindeutig miteinander vergleichen zu können, sollte diese zuvor mit Hilfe einer Restriktionsendonuclease linearisiert werden.

Weitere Informationen zur Methode

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