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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 2 von 9

Praktikum 1: DNA-Isolierung

Versuchsdurchführung: Plasmid-DNA-Isolierung nach der Minilysat-Methode

Beim Umgang mit Nucleinsäuren ist stets darauf zu achten, dass alle Materialien frei von Nucleasen sind. Puffer, Lösungen, Pipettenspitzen und Eppendorfgefäße müssen unbedingt steril sein und sollten nicht ohne Handschuhe angefasst werden, da sich auch auf der Haut Nucleasen befinden.

Abb.1
Isolierung von Plasmid-DNA

Arbeitsprotokoll zur DNA-Isolierung

Am Abend des Vortages werden von einer Agarplatte (Bezeichnung notieren) mit Einzelkolonien 12 Kolonien mit je einer gelben Pipettenspitze in je ein Kulturröhrchen mit 3 mL (100 µg/mL Ampicillin) angeimpft. Diese 12 Kulturröhrchen werden über Nacht (oder mindestens 5 Stunden) bei 37 °C im Roller oder auf dem Schüttler inkubiert.

Am darauf folgenden Tag werden pro Ansatz jeweils zweimal ca. 1,5 mL der Kultur mit der 1.000 µl-Pipette in beschriftete Eppendorfgefäße gefüllt (also insgesamt 3 mL pro Ansatz) und für 5 min bei 6.000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und die Restflüssigkeit durch leichtes Abschlagen entfernt, so dass quasi nur noch das Pellet zurückbleibt.

Das Pellet wird mit 100 µl P1-Puffer versetzt und mit der Pipette oder auf dem Vortex vollständig suspendiert; eine echte Lösung wird in diesem Stadium noch nicht erreicht.

Jetzt werden jeweils 200 µl P2-Puffer zugegeben. Nach jeder Zugabe wird das entsprechende Gefäß sofort vorsichtig auf den Kopf gedreht und langsam durch weitere Drehungen gut durchmischt. Dieser Schritt sollte Probe für Probe mit 30 s Abstand voneinander durchgeführt werden. Die Reaktionsgefäße stehen nun jeweils für 5 min auf Eis. Bei diesem Schritt wird die gesamte DNA alkalisch denaturiert. In der gleichen Reihenfolge und mit dem gleichen Zeitintervall wird nach Ablauf der 5 min je 150 µl P3-Puffer zugegeben (NaOAc ist besonders gut im Alkohol-Wasser-Gemisch löslich). Nach kurzem Schütteln verbleiben die Gefäße für 30 min auf Eis.

Hinweis
Nach der Zugabe von SDS und NaOH sollte die Suspension nur durch Drehen des Eppendorfgefäßes, auf keinen Fall aber auf dem Vortex durchmischt werden. Scherkräfte führen sonst dazu, dass die chromosomale DNA stark fragmentiert wird und sich nicht mehr von der Plasmid-DNA trennen lässt. Der Lyse-Schritt sollte die Dauer von fünf Minuten nicht überschreiten, damit die Plasmid-DNA nicht zu stark denaturiert wird.

In der Zwischenzeit werden 12 neue Eppendorfgefäße beschriftet und mit jeweils 1 mL 99 %igen Ethanol gefüllt. Diese Gefäße bleiben gleichfalls auf Eis.

Die mit den Puffern vorbehandelten Proben werden nach Ablauf der 30 min in der Biofuge 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird sofort danach in das zugehörige mit kaltem 99 %igen Ethanol gefüllte Eppendorfgefäß dekantiert. Kleinere Mengen an Überstand verbleiben dabei in dem Reaktionsgefäß. Nach mehrfachem Drehen über Kopf (eine sorgfältige Durchmischung ist absolut notwendig) werden die Ansätze anschließend in der Biofuge 20 min bei 12.000 rpm zentrifugiert.

Hinweis
Wichtig: Die Gefäße bitte so in die Zentrifuge einstellen, dass man nach Beendigung des Laufes genau weiß, wo sich das Pellet befindet. DNA-Pellets sind, besonders bei sehr sauberer DNA, nicht sichtbar!

Der Zentrifugationsüberstand wird mit der Pasteur-Pipette so weit wie möglich abgenommen und verworfen. Die Spitze darf das Pellet dabei nicht verletzen (an der gegenüberliegenden Wand herunterführen)! Danach wird 1 mL 75 %iges eiskaltes Ethanol zugegeben (nicht schütteln!).

Hinweis
Wichtig: Das Ethanol darf nicht 100 %ig sein, weil sonst das Salz wieder ausfallen würde. Anstelle des 75 %igen Ethanols darf kein Wasser zum Waschen verwendet werden, da sich sonst die DNA wieder lösen würde.

Die Proben werden wie zuvor in die Biofuge gestellt und 5 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird erneut vorsichtig abpipettiert und die Proben im Exsikkator für 15 min getrocknet. Wenn genügend Zeit zur Verfügung steht, kann auch an der Luft getrocknet werden - je schonender der Trocknungsprozess, desto mehr Hydrathüllen bleiben erhalten, und desto besser wird sich die DNA später wieder lösen lassen. Anschließend wird die getrocknete DNA in 50 µl sterilem bidest. Wasser aufgenommen und gut resuspendiert.

Chemikalienliste

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