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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 2 von 9

Praktikum 1: DNA-Isolierung

CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation

Bei der Aufreinigung von DNA über die Dichtegradienten-Zentrifugation (isopyknische Zentrifugation) im Caesiumchlorid-Gradienten werden Nucleinsäuren anhand ihrer Dichte getrennt. Dieses Verfahren liefert hochreine, kovalent geschlossene Plasmid-DNA mit sehr guten Ausbeuten. Für die Dichtegradienten-Zentrifugation werden Vertikalrotoren verwendet, in denen die Röhrchen während der Zentrifugation parallel zur Rotorachse orientiert sind. Nach der Zentrifugation muss sich die Flüssigkeit von der Senkrechten in die Waagerechte umorientieren.

Abb.1
Animation zur Dichtegradienten-Zentrifugation
© Wiley-VCH

Das Prinzip der Trennung von chromosomaler und Plasmid-DNA erfolgt während der Zentrifugation in Gegenwart von Ethidiumbromid. Ethidiumbromid interkaliert zwar auch in Doppelstrang-DNA wie die kovalent geschlossene ringförmige Form (supercoil) des Plasmids, jedoch lagern lineare DNA-Doppelstränge oder durch einen Einzelstrangbruch geöffnete Plasmide (nicked circled-DNA) erheblich mehr Ethidiumbromid ein, das die Schwimmdichte dieser DNA-Formen erhöht. RNA-Ethidiumbromid-Komplexe weisen eine deutlich größere Dichte als die maximale Dichte des Gradienten auf und akkumulieren am Rand des Röhrchens.

Abb.2
CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation zur Isolierung von Plasmid-DNA

Aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichten können die supercoiled-Form und die lineariserte Form der DNA im Caesiumclorid-Dichtegradienten innerhalb des Zentrifugationsgefäßes getrennt werden.

Die DNA-Bande kann nach der Zentrifugation unter UV-Licht mit Hilfe einer Kanüle aus dem CsCl-Gradienten abgezogen werden.Vorsicht beim Umgang mit Ethidiumbromid! Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und ist daher mutagen!

Arbeitsprotokoll

Puffer und Lösungen

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