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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 6 von 9

Praktikum 3: DNA-Hybridisierung

Immunologische Detektion der Hybride

Während die Detektion der Hybride nach einer Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden einfach auf dem Auflegen eines Röntgenfilms besteht, sind bei der Verwendung enzymgekoppelter Substrate nach dem Waschen der Membran weitere Arbeitsschritte notwendig.

Abb.1
Detektion

Bei der Detektion des DIG-Haptens, die der letzte Schritt der Southern-Analyse darstellt, wird ein gegen das Digoxigenin gerichteter Antikörper sowie ein Chemolumineszenz-Substrat zugegeben. An diesen Antikörper ist eine alkalische Phosphatase gekoppelt, die das Substrat umsetzen kann, was zur Chemolumineszenz führt.

Arbeitsprotokoll

Abb.2
Chemolumineszenz-Reaktion mit CDP-Star

Alternative Verfahren

  • Alternativ kann auch ein Farbkonjugat verwendet werden, um digoxigenierte Hybride nachzuweisen. Auch hier wird als Erstes ein Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-Konjugat eingesetzt, das an die Digoxigenin-Reste der Sonde bindet. Dann werden 4,5 μL/mL NBT (Nitroblau-tetrazoliumchlorid) und 3,5 μL/mL BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-Toluidinsalz) in den Detektionspuffer (Roche) pipettiert. Positive Signale sind anhand einer violetten Färbung zu erkennen. Die Farbreaktion muss durch Waschen der Membran in bidest. Wasser oder in TE-Puffer gestoppt werden, sobald der Hintergund eine zu intenive Färbung annimmt. Die Membranen lassen sich längere Zeit unter Lichtabschluss aufbewahren, dunkeln aber mit der Zeit etwas nach.
  • Wenn Biotin zur Markierung verwendet wird, kann für die Nachweisreaktion die ausgesprochen starke Bindung zwischen Biotin und Streptavidin ausgenutzt werden. Biotin ist ein kleines Molekül, das von zwei der vier Biotin-Bindungsstellen eines Streptavidin-Moleküls gebunden wird. So lassen sich aus einem biotinylierten Enzym (Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase) und Streptavidin große dreidimensionale Komplexe bilden, die zur Intensität der Nachweisreaktion beitragen. Die Farbreaktion selbst wird durch Zugabe von 0,05 % 3,3-DAB (3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid) oder dem Chromogen 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC), einen Elektronendonator, der sich durch Oxidation in ein rotes Reaktionsprodukt umwandelt, und 1 % H2O2 gestartet.
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