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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 6 von 9

Praktikum 3: DNA-Hybridisierung

Versuchsdurchführung: Southern-Blot

Für die Hybridisierung werden DNA-Fragmente verwendet, die durch eine Restriktionsspaltung der DNA und anschließender elektrophoretischer Auftrennung gewonnen werden. Diese DNA-Banden sollen in diesem Versuchsteil durch einen Kapillarblot vom Agarose-Gel auf eine Membran transferiert werden.

Abb.1
Vorbereitung des Agarose-Gels
Abb.2
Southern-Blot

Hinweis: Die Geltaschen werden durch das Gel auf dem Filterpapier markiert und nicht wie im Video gesagt auf der Membran.

Vorbereitung des Agarose-Gels

Vor dem eigentlichen Transfer der DNA auf die Membran wird das Agarose-Gel einer Behandlung unterzogen, die die Nucleinsäuren im Gel depuriniert und denaturiert. Diese Vorbehandlung erhöht die Effizienz des Transfers und gewährleistet, dass die DNA später einzelsträngig auf der Membran vorliegt. In der Praxis wird das Gel im Anschluss an die Agarose-Gelelektrophorese für 15 min unter Schütteln zunächst in Depurinierungspuffer, dann zweimal für je 15 min in Denaturierungspuffer und schließlich zweimal für je 15 min in Neutralisierungspuffer inkubiert.

Lösungen zur Vorbehandlung des Agarose-Gels

Versuchsdurchführung Kapillarblot

  • Kapillarblot Für den Kapillarblot werden 6 Filterpapierstreifen sowie eine Membran auf Gelgröße zugeschnitten. Fünf der Papiere werden in 20x SSC2) angefeuchtet, in einer Schale gestapelt und das vorbehandelte Gel aufgelegt. Die Nylon-Membran wird luftblasenfrei auf das Gel aufgebracht und mit einem Filterpapierstreifen bedeckt. Es folgen Schichten aus saugfähigem trockenen Papier in Gelgröße, die abschließend beschwert werden. In die Schale wird etwas 20x SSC gegeben. Durch die Kapillarkräfte des Papiers wird diese Lösung nach oben durch das Agarose-Gel gesaugt. Dabei werden die im Gel befindlichen DNA-Moleküle mitgenommen und auf die Nylon-Membran übertragen.Am nächsten Versuchstag wird der Blot bis zur Membran abgebaut. Membran und Gel werden zusammen umgedreht. Die Geltaschen werden mit einem Bleistift auf der Membran markiert und die DNA durch UV-cross-linking (z.B. mit dem UV-Crosslinker, Stratagene) auf dieser durch Vernetzung fixiert. Die Membran kann nach dem cross-linking für längere Zeit trocken und im Dunkeln aufbewahrt werden, bevor die Hybridisierung durchgeführt wird.
Hinweis
Auf Nylon-Membranen kann die DNA-Fixierung auch durch Backen bei 80 °C für 2 h im Vakuum oder Backen bei 120 °C für 30 min erfolgen. Hier ist den Herstellerangaben für den jeweiligen Membrantyp zu folgen!

SSC-Puffer

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