zum Directory-modus

Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 6 von 9

Praktikum 3: DNA-Hybridisierung

Die Hybridisierungstemperatur

Einer der wichtigsten Faktoren für eine Hybridisierung ist die Wahl der richtigen Temperatur. Ist diese zu niedrig gewählt, können u.U. auch weniger stark homologe Bereiche erkannt werden, so dass falsch-positive Signale resultieren. Ist die Temperatur zu hoch, binden möglicherweise selbst homologe Sequenzen nicht an das Target.

Die optimale Temperatur einer Hybridisierung muss auf der Basis der DNA-Sequenz berechnet werden - eine DNA mit hohem GC-Gehalt hat beispielsweise eine andere Schmelztemperatur als eine DNA der gleichen Länge, die nur aus AT-Paaren besteht. Dieses liegt daran, dass zum Aufschmelzen eines GC-Paares drei Wasserstoff-Bücken anstatt zwei (für ein AT-Paar) gelöst werden müssen - und das erfordert mehr Energie. Aus dem gleichen Grund ist auch die Länge der DNA relevant - je mehr Nucleotide an der Bindung beteiligt sind, desto höher ist auch die Schmelztemperatur dieser DNA. Und nicht zuletzt spielen Faktoren wie die Na+-Konzentration (je höher, desto stabiler wird das Hybrid) oder auch das Lösungsmittel eine Rolle. Wenn der Ansatz das apolare Formamid enthält (wie beim Umgang mit RNA), wird der Doppelstrang destabilisiert, so dass die Hybridisierungstemperatur gesenkt werden muss. Jeder mismatch, d.h. jedes ungepaarte Nucleotid, senkt die optimale Hybridisierungstemperatur ebenfalls.

Mit folgender Formel lässt sich die Temperatur unter Berücksichtigung dieser Parameter abschätzen:

Tm = 81,5 °C + 0,41 x (% GC) + 16,6 log [Na+-Konzentration] - (820:L) - 0,61 x (% Formamid) - 1,4 (% mismatch)

(Tm = Schmelztemperatur, L = Länge der Sonde. Die Hybridisierungstemperatur sollte etwa 5-10 °C unter der Schmelztemperatur für DNA/DNA-Hybride, bei DNA/RNA-Hybriden reichen 5 °C.)

Hinweis
Längere E. coli-DNA-Fragmente werden üblicherweise bei 68 °C hybridisiert.

Primer und andere kleine DNAs

Für kleinere DNAs wie beispielsweise Primer werden andere Näherungsformeln verwendet. Um die Annealing-Temperatur der Primer bei der PCR zu schätzen, hat sich in der Praxis die (4+2)-Regel bewährt: Dabei werden für jedes Cytosin und jedes Guanin 4 gezählt, für jedes Adenin und jedes Thymidin 2. Diese Summe abzüglich 5-10 °C ergibt die ungefähre Annealing-Temperatur. Unterscheiden sich die Annealing-Temperaturen der beiden Primer erheblich, muss die geringere Temperatur gewählt werden.

Seite 8 von 10