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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 8 von 9

Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Die Nucleotide

Abb.1
2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat

In der PCR1) werden Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) als Substrat für die DNA-Polymerase eingesetzt. Die optimale Konzentration dieser dNTPs ist wichtig: Bei niedrigen Nucleotid-Konzentrationen arbeitet die Polymerase zwar präziser als bei höheren Konzentrationen, dafür ist mit Ausbeuteverlusten zu rechnen. Folgende Grundregeln haben sich in der Praxis bewährt:

  • Triphosphat-Lösungen sollten möglichst frisch sein. Nach längerer Lagerung können Hydrolyseprodukte2) hemmend wirken.
  • Die vier Nucleotide sollten in etwa äquimolaren Mengen vorliegen.
  • Die in der Literatur angegebenen Konzentrationen schwanken erheblich und nennen optimale Nucleotid-Konzentrationen von 50-500 μmol/L. Als guter Ausgangswert ist 200 μmol/L (pro Nucleotid) anzusehen, ggf. muss ein PCR-Ansatz in dieser Hinsicht optimiert werden.
  • Die dNTP-Konzentration beeinflusst die Konzentration des freien Magnesiums in der Lösung. Bei hohen dNTP-Konzentrationen muss auch die Magnesium-Konzentration entsprechend angepasst werden, sonst kann die Polymerase nicht arbeiten.

Modifizierte Desoxynucleosidtriphosphate

Die Verwendung modifizierter dNTPs ist eine elegante Methode, modifizierte DNA für sehr unterschiedliche Anwendungen herzustellen. Die Polymerasen akzeptieren Modifikationen der dNTPs in quasi allen Positionen, die nicht in die Spezifität der Watson-Crick-Basenpaarung eingreifen. In der Tabelle sind einige Beispiele aufgeführt.

Tab.1
Beispiele für die Verwendung unterschiedlich modifizierter dNTPs
NucleotidAnwendungFunktion
Didesoxy-NTPs (ddNTPs)Didesoxysequenzierung von DNAAbbruch der Sequenzierungsreaktion, da kein freies 3'-OH mehr vorhanden ist
basenmodifizierte dNTPs (7-Deaza-dGTP, dITP)(automatische) DNA-Sequenzierungdie Unterdrückung von Sekundärstrukturen verbessert das Sequenzierungsergebnis
Fluoreszenz-markierte dNTPsautomatische DNA-SequenzierungEinbau einer nicht-radioaktiven Markierung, die aufgrund ihrer Fluoreszenz detektiert werden kann
radioaktiv markierte dNTPsHerstellung eines markierten PCR-ProduktesEinbau einer radioaktiven Markierung zur Detektion
biotinylierte dNTPsnicht-radioaktive Markierungdas Produkt kann später nicht nur detektiert, sondern z.B. über eine Bindung an Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen auch isoliert werden (u.a. bei der Einzelstrang-Sequenzierung)

Ergänzende Informationen

Lerneinheit "Einführung in den Aufbau der Nucleotide"

Seite 7 von 17