zum Directory-modus

Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 8 von 9

Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Die Komponenten eines PCR-Assays

Die genaue Zusammensetzung eines PCR1)-Ansatzes hängt davon ab, welche Art von DNA-Polymerase oder welche markierten Oligonucleotide bei dieser Reaktion eingesetzt werden. Während früher PCR-Puffer oder Nucleosidtriphosphat-Lösungen im Labor selbst hergestellt wurden, oft auch mit Abstrichen bezüglich der Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, sind heute PCR-Kits kommerziell erhältlich, in denen alle Bestandteile der PCR im optimalen Verhältnis verfügbar sind.

Die genaue Zusammensetzung der Puffer und anderer Bestandteile des Kits ist oft nicht bekannt. Grundsätzlich sind für eine PCR folgende Bestandteile notwendig:

  1. Ein doppelsträngiges DNA-Molekül (das so genannte Template, auch DNA-Matritze genannt). Dieses Molekül ist die Vorlage, die in der PCR vervielfältigt werden soll. Mitunter ist das Ausgangsmolekül eine RNA, diese muss aber dann erst mit Hilfe einer reversen Transkriptase in eine DNA umgeschrieben werden.
  2. Zwei kurze, zur DNA-Matritze komplementäre Oligonucleotide (Primer), die an die DNA binden und die Startstelle für die DNA-Polymerase liefern.
  3. Eine temperaturstabile DNA-Polymerase zur Katalyse der DNA-Synthese im entsprechenden Reaktionspuffer.
  4. Die vier Desoxynucleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP als Substrate für die DNA-Polymerase.
  5. Magnesium-Ionen und ggf. weitere Zusatzstoffe, die für die jeweils verwendete Polymerase spezifisch sind.

Ein typischer PCR-Ansatz

Hinweis
Magnesium (Mg2+) spielt eine wichtige Rolle bei der Polymerisationsreaktion. Dieses zweiwertige Kation sättigt nicht nur die negativen Ladungen des Phosphat-Rückgrats der DNA, sondern stabilisiert auch die Konformation der einzelnen Nucleotidtriphosphate.
Seite 3 von 17