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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 8 von 9

Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Einfügen von Deletionen in der Praxis: Primer-Aufarbeitung und PCR

Reinigung der Oligonucleotid-Primer

Vor der Durchführung der PCR muss zunächst der Primer gereinigt und die Konzentration optimal eingestellt werden. Das Template/Primer-Verhältnis ist für eine erfolgreiche PCR sehr wichtig - sind zu viele Template-Moleküle im PCR-Ansatz, sinkt die Ausbeute an PCR-Produkt, während eine zu hohe Primer-Konzentration die Bildung unspezifischer PCR-Produkte fördert.

Die Oligonucleotide werden zumeist in ammoniakalischer Lösung geliefert und durch DNA-Fällung gereinigt:

  • 360 µL Oligonucleotid-Lösung
  • + 36 µL 3 molare NaOAc-Lösung
  • + 1,2 mL kaltes Ethanol (100 %, vergällt)
  • 12 h (mindestens 3 h) bei -20 °C
  • 15-30 min in der Biofuge bei 13.000 rpm1) zentrifugieren
  • waschen mit 200 µL kaltem, 80%igem Ethanol
  • Pellet in 50 µL bidest. H2O aufnehmen

Bestimmung der Primer-Konzentration

Zur Bestimmung der UV-Adsorption (260 nm) werden 2 % des Ansatzes 1:60 in einer 50 µL-Quarzküvette verdünnt. Die Menge an Oligonucleotid in den vorgegebenen 50 µL lässt sich wie folgt berechnen: Eine OD260 von 1 entspricht 20 µg/mL Oligonucleotide.

OD260 x Verdünnungsfaktor x 20 = Oligonucleotid-Konzentration in µg/mL

Die durchschnittliche molekulare Masse eines dNTPs beträgt 350 Da; diese Zahl ist mit der Länge des Oligonucleotids zu multiplizieren, um die optimale Primer-Konzentration zu berechnen, die bei 0,1-1 µM liegen sollte.

Durchführung der PCR

In einem 0,5-mL-PCR-Gefäß wird folgender Ansatz zusammenpipettiert:

Tab.1
Zusammensetzung des Ansatzes
MengeZusatz
5 µL (0,5-1 µM)Primer pUC19-1
5 µL (0,5-1 µM)Primer pUC19-2
5 µL20 x Puffer
6 µL25 mM MgCl2
1,5 µLTfl-DNA-Polymerase
0,5 µLpuc19-DNA (Template)
3 µLNucleosid-triphosphat-Mix
= 26 µL+ 74 µL bidest. H2O

Der Ansatz wird gemischt und dann in den Thermocycler gestellt. Dieser wird wie folgt programmiert:

Tab.2
Programmierung des Thermocyclers
VorgangReaktionsbedingungen
Denaturierung90 °C, 1 min
Annealing54 °C, 1 min
Elongation74 °C, 4 min, 20 Zyklen
Endsynthese72 °C, 10 min

Nach Ablauf des Programms (circa 1,5 h) wird der PCR-Ansatz entnommen. Um nun die Enden zu glätten, d.h. um möglicherweise nicht komplett abgelaufene Synthesen zu vervollständigen, wird jetzt mit dem Klenow-Fragment der E.-coli-DNA-Polymerase I behandelt:

Tab.3
Ansatz für die Nachbehandlung
MengeZusatz
100 µL PCR-Ansatz
+ 2 µL dNTPs
+ 1 µL Klenow-Polymerase

Die Reaktion erfolgt für 20 min bei Raumtemperatur.

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