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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 8 von 9

Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Die Mutagenese mit inverser PCR

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Abb.1

Mit einer PCR1) kann ein DNA-Fragment gezielt verändert werden, so z.B. bei der inversen PCR. Neben dem Austausch eines Nucleotids gegen ein anderes Nucleotid (Punktmutation) lassen sich mit dieser Methode auch zusätzliche Nucleotide einfügen (Insertionen) oder Nucleotide aus der Basensequenz des DNA-Moleküls entfernen (Deletionen).

Teil A (Abb. 1) erläutert das Prinzip dieser PCR-Mutagenese.

Dann werden zwei Reaktionen (PCR 1 und PCR 2 aus (Abb. 2) ) durchgeführt, bei denen jeweils einer der beiden komplementären Primer (Primer 2 und Primer 3) eine Mutation enthält - z.B. einen Basenaustausch, eine Deletion oder eine Insertion, die in die beiden Stränge der neu entstehende DNA eingefügt werden soll.

Aus dieser Reaktion entstehen also zwei DNA-Doppelstränge mit jeweils einem oder mehreren fehlgepaarten Nucleotiden (mismatches, hier als Punkt/Kreis dargestellt).

Der zweite Schritt der Mutagenese

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Abb.2

Der Begriff "inverse PCR" bezeichnet ein PCR-Verfahren, bei dem im ersten Schritt nicht das zwischen zwei Primern gelegene Stück DNA amplifiziert wird, sondern die beiden Fragmente, die rechts und links der jeweiligen Primer liegen (siehe (Abb. 2) , PCR 1 und 2).

Im zweiten Schritt werden diese beiden im Primerbereich überlappenden DNA-Fragmente gemischt, zum ganzen Strang vervollständigt und in einer dritten PCR amplifiziert.

Dazu werden insgesamt vier Primer benötigt. Die beiden Primer 2 und 3 dienen dazu, die gewünschte Mutation in Strang und Gegenstrang einzubringen. Die zwei Gegenprimer 1 und 4 passen exakt auf die Ausgangs-DNA und flankieren den gesamten gewünschten DNA-Bereich. Die entstehenden Fragmente (Produkte 1-4) werden gemischt und von der Polymerase vervollständigt. Eine erneute PCR mit Primer 1 und 4, den beiden das gesamte Fragment flankierenden Primern, führt zur Amplifikation der nun mutierten DNA.

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