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Tutorial MenueMethoden der GentechnologieLerneinheit 8 von 9

Praktikum 5: Inverse PCR - Deletion von Genabschnitten

Fusionsproteine

Proteine können nach einer Genexpression in Bakterien oder eukaryontischen Zellen entweder direkt aus dem Kulturüberstand oder den Wirtszellen isoliert werden. Diese Isolierung ist fast immer kompliziert, da das gewünschte Protein aus der Masse der anderen zellulären Proteine aufgrund seiner besonderen Eigenschaften abgetrennt werden muss - aber die Eigenschaften unterscheiden sich oft kaum von den Eigenschaften der anderen zellulären Proteine. Diese Methode ist zeitaufwändig und führt nur selten zu einem Proteinisolat, das nicht mit anderen Proteinen verunreinigt ist.

Zur Isolierung von Proteinen werden daher bevorzugt Fusionsproteine hergestellt. In diesem Fall sind der eigentlichen Proteinsequenz bei der Klonierung einige Nucleotide hinzugefügt worden, die dem Protein entsprechend zusätzliche Aminosäuren anfügen. Über diese zusätzlichen Aminosäuren lässt sich das Protein später isolieren - auf der Basis von Bindungseigenschaften, wie sie z.B. in der Affinitätschromatographie Anwendung finden.

Im hier gezeigten Beispiel wird der Aminosäure-Sequenz ein Hexa-Histidin-Rest hinzugefügt (Teil B, (Abb. 2) ). Diese Sequenz von sechs Histidin-Resten ermöglicht eine Reinigung des Fusionsproteins durch Nickel-Affinitätschromatographie.

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Abb.1
In drei Schritten

(A) : Diese Methode entspricht im Prinzip einer Mutagenese mittels PCR. Primer 1 und 4 tragen jeweils an ihrem 5'-Ende zusätzliche Nucleotide, die zur Template-DNA nicht komplementär sind. Diese zusätzlichen Nucleotide sind aber zueinander komplementär und lassen sich nach den beiden ersten (PCR 1 und PCR 2) in einer dritten PCR direkt verbinden, so dass in dieser PCR nun ein DNA-Fragment entsteht, welches für das gewünschte Fusionsprotein codiert - also ein Gen, das zusätzlich zur Proteinsequenz noch die Sequenz für die sechs Histidin-Reste am N- oder C-Terminus trägt.

Dieses DNA-Fragment muss nun in passende Restriktionsschnittstellen eines Klonierungsvektors integriert und über eine Transformation z. B. in E. coli-Zellen eingebracht werden, in denen das Fusionsprotein synthetisiert wird. Diese Methode ist deutlich aufwändiger als das unter (B) beschriebene Einschrittverfahren, bei dem in der PCR direkt die gewünschte Fusionsproteinsequenz plus Klonierungsvektor erzeugt wird.

Abb.2
PCR-Einschrittverfahren

(B) : Bei diesem Verfahren wird in der PCR gleich ein DNA-Fragment erzeugt, das nicht nur die Sequenz für das gewünschte Protein samt Hexa-Histidin-Tag enthält, sondern auch alle Anteile eines Plasmids besitzt, das in E. coli vermehrt und über die Antibiotika-Resistenz selektiert werden kann (im hier gezeigten Beispiel eine Resistenz gegen Ampicillin).

In (Abb. 2) wurde in das Ausgangsplasmid mit dem origin of replication [4] - dem Replikationsursprung, den jedes Plasmid für eine Vermehrung in der Zelle benötigt - und der Ampicillin-Resistenz [3] zunächst die DNA-Sequenz für das gewünschte Protein eingebracht [6]. ATG [5] ist das Start-Codon, TAG [2] das neue Stop-Codon. Diese beiden Codons begrenzen den DNA-Bereich für das gewünschte Protein, sie signalisieren dem Ribosom an welcher Stelle es mit der Proteinsynthese beginnen und wieder aufhören soll. Der grau markierte Teil des Ursprungsplasmids [8] mit dem alten Stop-Codon [7] wird bei der PCR ausgelassen. Des Weiteren wird in das Protein noch eine DNA-Sequenz eingefügt, die sechs Histidin-Reste am Ende des Proteins (dem C-Terminus) addiert [1]. Diese DNA-Sequenz muss sich im korrekten Leseraster zum Rest des gewünschten Proteins befinden.

Nickel-Affinitätschromatographie

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