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DNA-Strukturen

Denaturierung - Renaturierung

Die DNA-Stränge können durch Erhitzen oder Zugabe von Alkali voneinander getrennt werden. Die thermische Denaturierung löst dabei alle Wechselwirkungen zwischen den Basen gleichzeitig auf. Es kommt zu einem kooperativen Schmelzen, das sich besonders gut spektroskopisch verfolgen lässt. Ähnlich wie bei der Schmelzpunktbestimmung kristalliner Substanzen kommt es beim Schmelzen der DNA bei einer bestimmten Temperatur zu einem plötzlichen Zusammenbruch der doppelhelicalen Struktur.

Die Doppelhelix schmilzt zu zwei Einzelsträngen auf. Die Temperatur, an der die Hälfte der DNA einzelsträngig vorliegt, wird als Tm bezeichnet. Der Schmelzvorgang lässt sich durch UV-Spektroskopie nachweisen, weil mit der Ausbildung der Stapelwechselwirkungen ein Energiegewinn verbunden ist und die Gesamtabsorption des Polymers 1,4 mal schwächer ist als die Absorption derselben molaren Menge von Einzelnucleotiden. Mit Hilfe der UV-Spektroskopie lassen sich leicht Stabilitäts-/ Schmelzprofile für genomische DNA erstellen. Die Stabilität der DNA ist proportional zu ihrem CG-Gehalt. So hat man besonders in der Mikrobiologie versucht, unterschiedliche Organismen zu klassifizieren. Auch thermostabile Organismen enthalten jedoch immer einen Mindestanteil an Adenosin und Thymidin. Aus den Schmelzanalysen allein lässt sich nicht erklären, warum es Lebewesen gibt, die ein Wachstumsoptimum >106 °C besitzen. Hier spielen viele andere Faktoren eine zusätzliche Rolle.

Abb.1
Denaturierungskurven verschiedener DNAs

Links die Kurve für AT-haltige, rechts die Kurve für GC-haltige DNA. In der Mitte ist eine Kurve für eine natürliche DNA mit statistischer Basenzusammensetzung dargestellt.

Nicht nur das Schmelzprofil eines DNA-Strangs ist charakteristisch, sondern auch das Profil der Reassoziation. Dies wird häufig auch als Reannealing bezeichnet. Kühlt man die denaturierte DNA wieder ab, finden die komplementären Stränge wieder zueinander. Die Geschwindigkeit der Reassoziation hängt von unterschiedlichen Faktoren ab. Dabei sind die Konzentration der Kationen, zum Abpuffern der negativen Ladung des Backbones, die Temperatur, bestenfalls 25 °C unter Tm und die Größe und Konzentration der DNA-Stränge von besonderer Bedeutung. Außerdem beschleunigen so genannte repetitive Sequenzen die Reassoziation. Die Reassoziation ist ein zweistufiger Prozess. Der erste Schritt ist die Nucleation. Sie beschreibt das Zusammenfinden der ersten komplementären Basenpaare. Dieser Schritt ist der langsamere und damit der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Der zweite, schnellere Schritt ist das Ausbilden der restlichen Basenpaare.

Während die natürlich vorkommende DNA stets einen sehr hohen Schmelzpunkt von mindestens 85°C aufweist, zeigen synthetische DNAs Schmelzpunkte, die bis zu einer Kettenlänge von 50 Basenpaare (bp) annähernd proportional zum GC-Gehalt und zur Kettenlänge sind. An den offenen Enden kommt es zum sog. Atmen, weil sich die Enden permanent öffnen und schließen. Das Schmelzverhalten von so genannten Oligonucleotiden spielt bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine entscheidende Rolle und wird dort ausführlich behandelt.

Das Denaturieren-Renaturieren lässt sich für Abstammungsnachweise verwenden. Hierbei wird DNA von zwei unterschiedlichen Spezies geschmolzen und die Einzelstränge werden zur Reassoziation in einem Reaktionsgefäß vereinigt. Anschließend wird ausgewertet, wie viele Hybride sich gebildet haben. Die Häufigkeit von Hybriden ist ein Maß für die Verwandtschaft der beiden Organismen. Dieser Ansatz kann selbstverständlich auch nur für DNA-Abschnitte durchgeführt werden. Allerdings wird dieses Verfahren heute kaum noch angewendet, weil die direkte DNA-Sequenzierung sehr viel genauere Analysen erlaubt.

Die Zugabe von Alkali ist eine besonders effektive Methode, die DNA-Stränge schnell und vollständig zu trennen. Dabei werden der DNA die Protonen entzogen, die die Wasserstoff-Brückenbindungen zwischen den Basen bilden. Die Basen verlieren ihre quasi-aromatische Struktur und reduzieren die Elektronen in den Stapelwechselwirkungen. So reichen die Stapelkräfte nicht mehr aus, um die Abstoßung des negativ geladenen Zucker-Phosphat-Backbones zu kompensieren. Es kommt zu einer extrem schnellen Strangtrennung, die man bei der sog. alkalischen Lyse zur Plasmid-Isolierung ausnutzt.

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