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Tutorial MenueNucleinsäurenLerneinheit 2 von 3

Bausteine der Nucleinsäuren

Benutzung der optischen Dichte

In der Nucleosid-Chemie hat sich eine Besonderheit eingebürgert, die es für Anfänger schwer macht, quantitative Zusammenhänge schnell zu erfassen. Während nämlich sonst Stoffmengen in Gramm angegeben werden, werden Nucleoside fast immer in der Einheit optische Dichte (O.D. oder OD) angegeben. Der Grund dafür liegt in der außerordentlichen Empfindlichkeit der UV-Spektroskopie, die es schlussendlich erlaubt mit ng-Mengen zu arbeiten, also in einem Bereich, in dem auch moderne elektronische Waagen versagen. Deshalb ist es an dieser Stelle unbedingt notwendig, den Begriff der OD einzuführen.

Zunächst gilt das Lambert-Beer'sche Gesetz:

Gesetz
E = lg ( I 0 I ) = ε c d E : Extinktion I 0 : Intensität des eingestrahlten Lichtes I : Intensität des abgeschwächten Lichtstrahls ε : Extinktionskoeffizient c : Konzentration d : Schichtdicke

Diese Gesetz besagt, dass die Extinktion (E) dem Logarithmus aus dem Verhältnis von Ausgangsintensität (I0) zur gemessener Intensität (I) entspricht. Die Intensität bezieht sich auf den Lichtstrom, der in eine Probelösung eingestrahlt wird und beim Probendurchgang mindestens teilweise absorbiert wird.

Wir erkennen aus dem Gesetz, dass die Extinktion (E) abhängig sein muss von der Schichtdicke (d) und der Stoffkonzentration (c). Außerdem erkennen wir, dass die Absorption von den physikalischen Eigenschaften des Stoffes abhängt. Dafür wurde der molare Extinktionskoeffizient ε eingeführt. Kennt man nun ε und hält man die Schichtdicke konstant, so kann man aus der Absorption direkt auf die Konzentration schließen. Kennt man das Volumen, so kennt man auch die absolute Stoffmenge. Das ist ein sehr bequemer Weg, der sich in der Nucleosidchemie bzw. in der Biochemie eingebürgert hat.

Praxisprobleme

Es gibt jedoch Probleme beim Umgang mit der optischen Dichte, die am besten an einem konkreten Beispiel erläutert werden.

Sie kaufen bei einer Firma 1,0 A260 Einheiten eines Oligonucleotids (z.B. eines PCR-Primers). Wenn Sie die gelieferte Menge in 1 ml doppelt-destilliertem Wasser lösen und in einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 1,0 cm bei 260 nm messen, erhalten Sie den Messwert 1,0.

Hinweis
Achtung: Es ist Konvention, mit dieser Schichtdicke zu messen. Änderungen der Schichtdicke führen unweigerlich zu falschen Ergebnissen. Es gibt Küvetten, die Messungen in einem Volumen von 100 bis 200 μl erlauben.

Das entspricht 33 μg Oligonucleotid bzw. 0,1 mM bezogen auf die Einzelnucleotide. Sie können diese Menge auch in einem deutlich kleineren Volumen lösen (z.B. in 100 μl), dann allerdings würden Sie einen Messwert von 10,0 messen. Trotz aller modernen Elektronik ist dieser Messwert aber mit einem erheblichen Fehler behaftet, da es sich um die Bestimmung des Restlichtes handelt, also um einen sehr kleinen Wert. Hier täuscht die Elektronik eine Genauigkeit vor, die nicht existiert. Stellen Sie Ihre Lösung so ein, dass sie zwischen 0,2 und 1,0 OD messen. Das Geräteoptimum liegt stets bei 0,3 - das entspricht 50 % Absorption, das wiederum sind in Logarithmen -log 0,5 = 0,3.

Hinweis
Achtung: Zeigerinstrumente sind stets in der Mitte am empfindlichsten.

1,0 A260-Einheiten entsprechen

  • 50 μg/ml doppelsträngiger DNA
  • 33 μg/ml einzelsträngiger DNA
  • 40 μg/ml einzelsträngiger RNA

1 μg eines 1000 Basenpaare großen DNA-Fragments entspricht 1,52 pmol = 9,11011 Moleküle. Da Sie bei der PCR mit einem einzelnen Ausgangsmolekül beginnen können, entspricht also 1,0 A260 einem mehr als 1013-fachen Überschuss, also mehr als genug.

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