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Tutorial MenueChromatographieLerneinheit 3 von 9

Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)

UV/VIS-Detektor in der HPLC

Abb.1

Der UV/VIS-Detektor ist der in der HPLC am häufigsten genutzte Detektor. Er kann prinzipiell alle Verbindungen detektieren, die im UV- oder im VIS-Bereich Licht absorbieren. Verbindungen, die nicht in diesem Bereich absorbieren, können durch Derivatisierung (z.B. mit aromatischen Derivatisierungsreagenzien) so umgewandelt werden, dass sie detektierbar werden. Je kurzwelliger die Detektionswellenlänge gewählt wird, umso mehr Verbindungen sind detektierbar (unspezifische Arbeitsweise). Im langwelligeren Bereich (visueller Bereiche) absorbieren vergleichsweise wenige Verbindungen, weswegen die Wahl einer solchen Wellenlänge eine erhöhte Selektivität des UV-Detektors ermöglicht. Der UV-Detektor kann somit an die jeweilige Aufgabenstellung angepasst werden.

In der modernen HPLC werden verschiedene Varianten an UV/VIS-Detektoren eingesetzt:

Festwellenlängengeräte (Photometer)
Lichtquelle: z.B. Quecksilberdampf-Lampen, λ = 254nm (spielen nur noch eine untergeordnete Rolle)
Geräte mit variablen Wellenlängeneinstellungen (Spektrometer)
Lichtquelle: z.B. Deuterium-Lampe, λ = 190-370nm (spielen nur noch eine untergeordnete Rolle) (senden ein kontinuierliches Spektrum aus)
Diodenarray-Detektoren
zeichnen das Chromatogramm in Abhängigkeit von der Zeit, der Absorption und der Wellenlänge auf

Detektionsprinzip

Die Absorption der eingestrahlten UV/VIS-Strahlung durch den Analyten ergibt sich aus dem dekadisch logarithmierten Quotienten aus der Intensität des Strahlenganges ohne Probe und aus der Intensität nach Durchstrahlung der Probe.

Bei monochromatischer Strahlung gilt ein linearer Zusammenhang zwischen Absorption (Absorbanz) und Konzentration (analog zum Lambert-Beer'schen Gesetz):

A 10 = lg ( I 0 I tr ) = ε c l
Legende
A 10 -dekadische Absorbanz
I 0 -Intensität des eingestrahlten Lichtes [ W m-2 ]
I tr -Intensität des abgeschwächten Lichtes [ W m-2 ]
ε -molarer (dekadischer) Absorptionskoeffizient
c -Konzentration der Probe
l -Weglänge des Lichtstrahls durch die Probe

Die Absorption hängt auch von der Weglänge des Lichtstrahls durch die Probe ab. Somit wird von den Geräteherstellern ein möglichst tiefer Probenraum gewählt, durch den das Licht einen weiten Weg durch den Analyten hat. Dagegen findet aber bei größeren Zellvolumen eine stärkere Bandenverbreiterung der Peaks statt, sodass ein Kompromiss gefunden werden muss.

Abb.2
Verwendete Durchflusszellen in spektroskopischen Detektoren

Die Durchflusszellen sind nur mit sehr kleinen Durchmessern versehen, dafür aber mit langem Lichtweg.

Die Sensitivität des Detektors für einen Analyten ist am größten, wenn die Wellenlänge gewählt wird, bei der im UV-Spektrum des Analyten ein Maximum vorliegt. Komplette UV-Spektren enthalten relativ wenig Information über die Struktur des Analyten und benötigen durch die geringe Anzahl von Scans pro Zeiteinheit lange für die Aufnahme, deshalb wird häufig bei nur einer Wellenlänge detektiert.Der Eluent mit dem Analyten fließt durch eine kleine Durchflusszelle, die sich im Strahlengang eines UV/VIS-Photometers oder Spektrometers befindet. Dabei gibt es viele Varianten in den Ausführungen (z.B. Geräte mit Filtern oder Monochromatoren, o.ä.).

Abb.3
Prinzip eines UV/VIS-Detektors mit einem Prisma und Spalt als Monochromator

Die Selektivität des UV/VIS-Detektors kann durch die Wahl der Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes variiert werden.

Die Absorption von UV-Strahlung muss auch für die Auswahl des Eluenten bedacht werden. Es ist für jeden Eluenten eine minimale Messwellenlänge gegeben, da unterhalb dieser das Lösemittel selbst absorbiert und die Probe somit nicht mehr gemessen werden kann.

Welche Verbindungen sind nachweisbar?

hauptsächlich aromatische und ungesättigte konjugierte Verbindungen, aber auch

  • Doppel- und Mehrfachbindungen
  • Carbonyl-Verbindungen (-C=O)
  • -Br, -I, (tlw. Schwefel- und Stickstoff-Verbindungen)
Tab.1
UV/VIS-Detektor
VorteileNachteile
▪ selektive bis unselektive Detektion möglich ▪ großer linearer Bereich ▪ gut geeignet zur Gradientenelution ▪ Substanzen werden nicht zerstört ▪Temperaturabhängigkeit (jedoch nur gering) ▪ Sauerstoff im Eluenten absorbiert UV-Strahlung sehr stark und muss deshalb sorgfältig entfernt werden
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