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Tutorial MenueChromatographieLerneinheit 3 von 9

Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)

Fluoreszenz-Detektor in der HPLC

Abb.1

Der Fluoreszenz-Detektor gehört ebenfalls zu den spektroskopischen Detektoren in der HPLC. Er ist jedoch bis zu 1000 mal sensitiver als der UV/VIS-Detektor und spricht selektiv auf Verbindungen an, die zur Fluoreszenz angeregt werden bzw. durch geeignete Umsetzung in fluoreszierende Derivate überführt werden können.

Detektionsprinzip

Seine höhere Empfindlichkeit gegenüber dem UV/VIS-Detektor verdankt der Fluoreszenz-Detektor einem anderen Messprinzip - der Emissionsmessung. Es wird keine Differenz zwischen zwei Lichtintensitäten gemessen, sondern eine emittierte Strahlung, wobei das Hintergrundsignal wirklich null ist, wenn kein Fluorophor anwesend ist.

Die Fluoreszenzintensität kann nach folgender Gleichung bestimmt werden:

F = 2,3 I ε c l Φ
Legende
I -Intensität des Anregungslichtes
ε -Absorptionskoeffizient
c-Konzentration
l -Weglänge des Lichtstrahls durch die Probe
Φ -Quantenausbeute der Substanz
Abb.2
Prinzip des Fluoreszenzdetektors

  • Die Probe wird in der Durchflussmesszelle mit UV-Strahlung einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt (Lichtquellen: Xenon-, Deuterium- oder Quecksilber-Lampen).
  • Verbindungen absorbieren das eingestrahlte Licht und emittieren ein längerwelliges entweder sofort (fluoreszieren) oder zeitverzögert (phosphoreszieren).
  • Das in alle Richtungen emittierte Licht der Probe wird lediglich senkrecht zur Einstrahlungsrichtung gemessen, um zu verhindern, dass das Anregungslicht auf die Photomesszelle (Photomultiplier) fällt.

Welche Verbindungen sind nachweisbar?

Hauptsächlich konjugierte cyclische Verbindungen sind nachweisbar:

  • mehrkernige aromatische Verbindungen
  • Substituenten am Aromaten können zur Fluoreszenzlöschung (Quenching) führen(-COOH, -NO2, SH-Gruppen)

Neben den Substituenten am Aromatenkörper können auch die mobile Phase (pH-Wert, Viskosität) und die Temperatur das Fluoreszenzverhalten der Probe beeinflussen. Sie müssen also auf das Detektionsverfahren abgestimmt werden.

Tab.1
Fluoreszenz-Detektor
VorteileNachteile
▪ selektive Detektion ▪ alle in der HPLC gewöhnlich verwendeten Eluenten sind keine Fluorophore, kaum Beschränkungen bei der Auswahl ▪ gut geeignet zur Gradientenelution ▪ Substanzen werden nicht zerstört ▪Temperaturabhängigkeit (jedoch nur gering) ▪ Eluentenbestandteile können zum Quenching der emittierten Strahlung führen
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