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Datenauswertung Chromatographie

Kalibrierung mit Standard-Lösungen mit internem Standard

Wenn Verluste von Probenbestandteilen oder andere systematische Fehler während der Probenvorbereitung oder der Analyse zu erwarten sind, wird die Anwendung eines internen Standards (= innerer Standard) notwendig.

Die Substanz, die als interner Standard Verwendung findet, ist eine probenfremde Komponente, die dem Analyten meist chemisch ähnlich, aber nicht mit ihm identisch ist. Sie wird in bekannter Konzentration zu jeder Probe und jedem Standard hinzugefügt. Sie dient also als relative Bezugsgröße. Wenn der interne Standard seine Konzentration verändert hat, wird angenommen, dass sich die Konzentration des Analyten in gleicher Weise verändert hat. Daher ist die Wahl der Substanz für den internen Standard von ganz entscheidender Bedeutung.

Die Mischungen, die als Kalibrierstandards gemessen werden, bestehen folglich aus den Komponenten, die bestimmt werden sollen (Analyten) und der internen Standardkomponente.

Voraussetzung für die Verwendung von internen Standards ist die Nutzung einer Analysenmethode, mit der simultan der interne Standard und die Analyten bestimmt werden können. Ideal für diese Technik ist die Chromatographie. Einzelkomponentenmethoden wie die Chlorid-sensitive Potentiometrie oder die AAS können in der Regel nicht mit der Methode des inneren Standards kalibriert werden.

Die Kalibrierfunktion

Die Kalibrierfunktion wird aus den Signalen der Messungen von einer oder mehreren Standardlösungen (bestehend aus internem Standard und Analyt) bekannter Konzentration erhalten. Hierzu wird eine Serie von Standardlösungen (Verdünnungsreihe) des Analyten hergestellt, die stets mit einer bekannten Menge an internem Standard versetzt werden. Die Signale y beider Komponenten werden für die Berechnung der Kalibrierfunktion genutzt.

Kalibrierfunktion von Standardlösungen (externe Standards)
Die Kalibrierfunktion wird durch die Geradengleichung ausgedrückt:
y A y i = b 0 + b 1 cA ci
Legende
b 0 -Absolutglied der Kalibrierfunktion (Offset)
b 1 -Steigung (Empfindlichkeit)
y -Signal
c-Konzentration
A -Analyt
i -interner Standard

Das Verhältnis der relativen Intensität eines Analytsignals zu dem Signal des internen Standards dient als analytischer Parameter. Zur Kalibrierung wird somit das Signalverhältnis Analyt/interner Standard verwendet.

Die Analysenfunktion

Analysenfunktion aus Standard-Lösungen mit internem Standard
Wird die Kalibrierfunktion nach der gesuchten Konzentration umgestellt, nennt man das Ergebnis Analysenfunktion.
cA = ci y A y i b 0 b 1

Mit Hilfe dieser Funktion wird die Konzentration der Probe berechnet. Die Anwendung der Gleichung setzt ein lineares Ansprechverhalten der analytischen Methode gegenüber dem Analyt und auch gegenüber dem Standard voraus.

Der interne Standard

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des internen Standards sollen denen des Analyten so weit wie möglich ähneln, damit sich beide Substanzen während der Analyse gleich verhalten. Der interne Standard sollte möglichst folgende Eigenschaften zeigen:

  • ähnliche Verteilungsverhältnisse der Atome/Moleküle
  • ähnliches Ansprechverhalten in der analytischen Methode
  • kein ursprünglicher Probenbestandteil
  • gleiche Stabilität in Kalibrierstandards und Proben
  • simultan bestimmbar mit der gleichen Methode wie der Analyt

Unter diesen Voraussetzungen können sich Schwankungen bei der Probenvorbereitung (z.B. Verflüchtigung des Lösungsmittels, Adsorption an Matrixbestandteilen, unvollständige Reaktion bei Derivatisierung) und Messung (z.B. Veränderung der Temperatur im Messgerät, Fehler bei injizierter Probenmenge) auf Analyt und internen Standard gleich auswirken und adäquat kompensiert werden. Als interne Standards werden häufig homologe "Verwandte" des Analyten verwendet, aber auch substituierte oder deuterierte Analytmoleküle.

Zusammenfassung

Tab.1
Kalibrierung mit Standard-Lösungen mit internem Standard
VoraussetzungenVorteileNachteile
▪ Geeignete Verbindung, die die Anforderungen an einen internen Standard erfüllt ▪ Nutzung einer Analysenmethode zur Mehrkomponenten-Bestimmung (z.B. Chromatographie) ▪ Möglichkeit der gleichmäßigen Verteilung des internen Standards in der Probe▪ hohe Reproduzierbarkeit des Zufügens des inneren Standards ▪ viele systematische Fehler wie Verluste, Anreicherungen, Wäge- und Volumenfehler kompensierbar▪ viele Proben ohne zusätzlichen Aufwand messbar, wenn die Kalibrierung über längere Zeit stabil ist ▪ viele Proben mit einer Kalibrierung auswertbar ▪ Standardlösungen z.T. wiederverwendbar ▪ nur wenige spezielle Matrixeffekte korrigierbar ▪ geeignete Verbindung mit chemisch und physikalisch ähnlichem Verhalten nicht leicht verfügbar ▪ Fehler, die nur beim internen Standard auftreten, verfälschen unbemerkt das Analysenergebnis ▪ Einarbeitung des internen Standards in die Probe nur begrenzt möglich (z.B. bei fester Matrix)

Weitere Anwendungen des internen Standards

Kontrolle der Konstanz eines Analysengerätes

In einigen Fällen ist es sinnvoll, den Probelösungen oder den Standardlösungen einen inneren Standard zuzusetzen, um die Veränderungen des Responses (Ansprechen) des Gerätes zu bemerken. Dann wird der innere Standard nicht zum Quantifizieren herangezogen, aber sein Signalwert wird z.B. in eine Regelkarte eingeschrieben und seine Veränderung beobachtet. Tritt eine signifikante Änderung dieses Signalwertes ein, wird eine erneute Kalibrierung des Systems notwendig. Der innere Standard dient bei dieser Arbeitsweise als Indikator (Anzeiger) für eine Änderung der Bedingungen.

Retentionszeit-Standard

Ein interner Standard kann auch sinnvoll sein, um einen festen Bezugspunkt auf der Zeitachse eines Chromatogramms zu setzten. Dies ist erforderlich, wenn die Injektion nicht durch einen Autosampler in definierter Weise erfolgt, sondern von Hand ausgelöst wird. Dem Chromatogramm fehlt dadurch die Startzeit. Man kann sich dann durch einen Zusatz eines probenfremden Stoffes behelfen, indem man zum Identifizieren der Peaks nicht die absolute Retentionszeit wählt, sondern die relative bezogen auf die Retentionszeit des internen Standards.

Ebenso sinnvoll können zwei interne Standards in der Chromatographie sein, um einen Bereich zwischen den beiden zu definieren, wo alle Peaks integriert und als Summe zur Gehaltsbestimmung herangezogen werden sollen. Diese Technik ist bei unübersichtlichen, nicht vollständig aufgelösten Chromatogrammen üblich, wenn die Stoffe der Probe nur einer Substanzklasse angehören. Beispiel hierfür ist die DIN zu Bestimmung von Kohlenwasserstoffmischungen wie Diesel in der Umwelt mittels Gaschromatographie.

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