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Tutorial MenueChromatographieLerneinheit 9 von 9

Datenauswertung Chromatographie

Qualitative Analyse in der Chromatographie

Ziel: Identifizierung eines oder mehrerer Peaks im Chromatogramm

Bei der chromatographischen Trennung einer Probe und der anschließenden Datenauswertung muss gesichert sein, dass keine Koelution einer Verbindung mit dem Analyten vorliegt.

Beispiel: Von der riesigen Anzahl bisher bekannter Substanzen sind etwa 107 chromatographierbar. Davon wiederum können nur ca. 100 Verbindungen über die Retentionszeit unterschieden werden. Das bedeutet, dass Koelutionen (also Peak-Verunreinigungen) oftmals sehr wahrscheinlich sind bzw. für korrekte Analysenergebnisse ausgeschlossen werden müssen.

Ein Peak gilt als identifiziert, wenn die Retentionszeit und die spektrale Übereinstimmung einen bestimmten Wert überschreiten, der vom Anwender festgelegt wurde (z.B. 98 %).

Die Identifizierung völlig unbekannter Peaks kann über verschiedene Verfahren erfolgen. Zum einen über nichtchromatographische Verfahren, die oftmals auf spektroskopische Untersuchungen hinauslaufen und somit erhöhten Aufwand an die technische Ausrüstung des Labors stellen, und zum anderen auf chromatographische Verfahren, bei denen aber erhöhter Arbeitsaufwand für eine Peak-Identifizierung mit vergleichbarer Sicherheit eingeplant werden muss.

Nichtchromatographische Verfahren

Ziel: Identifizierung unbekannter Substanzen

Die Kopplung der Chromatographiesäule mit strukturaufklärenden Analysentechniken ist heute die am häufigsten verwendete Methode zur Peak-Identifizierung. Die Einbeziehung umfangreicher Stoffdatenbibliotheken garantieren in vielen Fällen große Treffsicherheit und schnelle Aufklärung vieler Peaks im Chromatogramm (z.B. Kopplung GC-MS mit Spektrenbibliothek).

Möglichkeiten:

  • Chromatographie gekoppelt an spektroskopische Verfahren: IR-, NMR-, MS-, Raman-, UV/VIS-, Fluoreszenz-Spektroskopie
  • Sammeln von Fraktionen und die Kopplung an spektroskopische Verfahren
  • Sammeln von Fraktionen und weitere Verfahren: z.B. Elementanalyse AAS

Chromatographische Verfahren

Ziel: eine bekannte Substanz im Chromatogramm wiederfinden

Die chemische Natur der Probe muss also bekannt sein und die Probe muss als Referenz im Labor vorhanden sein. Ist dies der Fall, existieren verschiedene Möglichkeiten auf chromatographischem Wege eine Verbindung zu identifizieren:

Retentionsverhalten

Das Retentionsverhalten ist charakteristisch für jede einzelne Verbindung und hängt von verschiedenen Faktoren ab. Unter anderem:

  • Art des Analyten
  • Beschaffenheit der Säule und stationären Phase
  • Zusammensetzung der mobilen Phase
  • Temperatur usw.

Soll eine Verbindung (Analyt, Probe) über ihr Retentionsverhalten identifiziert werden, muss sie im Labor zur Verfügung stehen (Vergleichsstoff). Es wird eine Mischung aus Probe und Vergleichsstoff hergestellt, die unter verschiedenen Bedingungen (Eluent, stationäre Phase, anderer Detektor) chromatographisch getrennt wird. Handelt es sich bei der Probe und dem vermuteten Vergleichsstoff um dieselbe Verbindung, zeigen beide unter allen chromatographischen Trennbedingungen identisches Verhalten. D.h. es ist immer nur ein einzelner Peak zu beobachten. Besteht die hergestellte Mischung aus verschiedenen Verbindungen, zeigen diese teilweise (nur minimale) Unterschiede in ihrem chromatographischen Verhalten.

Abb.1
Beispiel für die Identifikation von zwei Inhaltsstoffen einer Probe durch Vergleich mit einer Mischung aus verschiedenen Verbindungen

Folgende Ergebnisse und Rückschlüsse sind möglich:

  • bei der Probe und dem Vergleichsstoff handelt es sich nicht um die gleiche Verbindung (Peakverbreiterung, Peak mit Schulter, zwei Peaks)
  • bei der Probe und dem Vergleichsstoff handelt es sich wahrscheinlich um die gleiche Verbindung (Peakform unverändert, Peakhöhe nimmt zu, ein Peak)

Diese Effekte treten bei hoher Trennstufenzahl stärker auf, als bei kleinen Trennstufenzahlen der Säule. Schwierig sind jedoch Isomere mit diesen einfachen chromatographischen Verfahren zu identifizieren.

Retentionszeiten bei verschiedenen Geräten

Häufig will man die am "eigenen" Gerät erhalten Retentionsdaten mit z.B. veröffentlichten Daten vergleichen. Dabei handelt es sich oftmals um andere Geräte (Bauart, Messprinzipien u.a.). Ist dies möglich?

Ja, am einfachsten an einem identischen Gerät und unter identischen Bedingungen (z.B. Säule).

Bei unterschiedlichen Geräten ist es kaum möglich direkt zu vergleichen, da das Retentionsverhalten der Probe von der stationären Phase, der Art und Menge der mobilen Phase, der Temperatur der Säule, der Flussrate, der Menge an gelöster Probe, dem Totvolumen des Gerätes, der Detektorgeometrie u.v.m abhängt. Aber vergleicht man nicht das absolute Retentionsverhalten der Probe, sondern bezieht es auf einen zugesetzten Stoff (interner Standard), lassen sich relative Retentionsdaten auch an unterschiedlichen Geräten miteinander vergleichen.

Analyse von funktionellen Gruppen

Es können spezielle stationäre Phasen zur Trennung verwendet werden, die auf bestimmte funktionelle Gruppen ansprechen, z.B. auf Kohlenwasserstoffe mit einer/mehreren Doppelbindungen. Hierbei ist der Logarithmus der Retentionszeit eine Funktion vom Grad der "Nicht-Sättigung". Ein weiteres Beispiel ist die Trennung nach molekularer Größe.

Identifizierung durch den Detektor

Wenn eine Probe unter identischen Bedingungen chromatographiert und anschließend mit mehreren unterschiedlichen Detektoren gemessen wird, sind die Verhältnisse der Signalhöhen der Detektoren für diese Probe charakteristisch. Als Beispiele seien hier die Kopplungen UV/VIS-Detektor und refraktometrischer Detektor oder zweier Photometer bei unterschiedlichen Wellenlängen in der HPLC genannt.

Die Identifizierung einer Probe wird durch selektive Detektoren erleichtert!

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