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Tutorial MenueAnalytische AnwendungsbeispieleLerneinheit 5 von 8

Quantitative Bestimmung von Vitamin C

Das HPLC-Chromatogramm von Zitronen-Saft

Der Saft frischer Zitronen enthält vergleichsweise viel natürliches Vitamin C (ca. 50 mg / 100 g ). Die Bestimmung des Vitamin C-Gehaltes mittels der HPLC ist bei Obst und Gemüse unproblematisch, da hier keine störenden Eiweiße beinhaltet sind. Wichtig ist jedoch die Stabilisierung der Ascorbinsäure zur Vermeidung ihrer Oxidation! Dazu wird häufig meta-Phosphorsäure-Lösung verwendet, die sowohl zur Extraktion als auch zur weiteren Verdünnung eingesetzt wird. Die Detektion kann mit einem UV-Detektor durchgeführt werden. Dabei ist zu beachten, dass die Extinktion der Ascorbinsäure nicht nur von ihrer Konzentration sondern auch vom pH-Wert der Lösung abhängt. Bei einer Wellenlänge von 250 nm wird der Wert der Extinktion nicht vom pH-Wert beeinflusst (isokratischer Punkt), daher ist eine Detektion bei genau dieser Wellenlänge sinnvoll und häufig angewandt.

Abb.1

Die Abbildung zeigt einen Ausschnitt des Chromatogramms von frisch gepresstem Zitronensaft. Dazu wurden 5 mL Saft mit 6%iger(G/V) meta-Phosphorsäure auf 250 mL verdünnt. Nach dem Abzentrifugieren fester Bestandteile wurde ein Teil der Lösung ultrafiltriert und mittels HPLC vermessen.

Als Elutionsmittel wurde ein Wasser/Methanol-Gemisch (20:1) unter Zusatz von Tetrabutyl-Ammoniumhydrogensulfat eingesetzt. Die Säulentemperatur wurde mit 30 °C möglichst niedrig gehalten, der Fluss des Elutionsmittes wurde auf 1 mLmin-1 geregelt.

Um die Peaks zuordnen zu können, müssen die Chromatogramme der entsprechenden Referenz-Substanzen unter gleichen Messbedingungen aufgenommen werden.

Vergleicht man Retentionszeiten einer meta-Phoshorsäure-Lösung und einer Lösung von L-Ascorbinsäure in meta-Phösphorsäure-Lösung zeigt sich, dass die Ascorbinsäure bei einer Retentionszeit von 2,6 min eluiert, die beiden anderen Peaks stammen von der Phosphorsäure.

Abb.2

Für eine Gehalts-Bestimmung muss eine Kalibriergerade aufgestellt werden. Dazu werden verschieden konzentrierte Standard-Lösungen der Ascorbinsäure hergestellt und mittels HPLC chromatographiert. Mit Hilfe der Kalibriergerade ist die Ascorbinsäure-Konzentration der untersuchten Probe bestimmbar.

Abb.3

Unter Berücksichtigung der Verdünnung lässt ermitteln, dass der Ascorbinsäure-Gehalt des Zitronensaftes 45,5 mg / 100 mL betrug.

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