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Tutorial MenueAnalytische AnwendungsbeispieleLerneinheit 5 von 8

Quantitative Bestimmung von Vitamin C

Gaschromatographie

Die Entwicklung der Gaschromatographie gab auch der Analytik des Vitamin C neue Impulse. Erstmals stand eine spezifische Methode zur Abtrennung und (quantitativen) Bestimmung der Ascorbinsäure zur Verfügung. Diese war im Unterschied zu anderen Reinigungsverfahren, wie der papierchromatographischen Trennung, nicht nur für bestimmte Materialien ausgearbeitet, sondern allgemein anwendbar und zum großen Teil unabhängig von der Kenntnis der reduzierenden Störsubstanzen in der Probe.

Aber: Ascorbinsäure lässt sich schwer verflüchtigen. Ein gasförmiger Analyt ist jedoch die Voraussetzung für eine GC-Analyse! Die Ascorbinsäure (analog: Dehydroascorbinsäure) muss daher vor der Bestimmung derivatisiert werden. Dazu wird die Substanz beispielsweise in ein flüchtiges Trimethylsilyl-Derivat überführt.

Silylierung

Abb.1
Tetra-Trimethylsilyl-Derivat der Ascorbinsäure

Ascorbinsäure wird meist mit Trimethylchlorsilan (TMCS) und Hexamethyldisilazan (HMDS) umgesetzt, weil sich die Kombination beider Silylierungsmittel auch bei der Untersuchung von Zuckerstoffen bewährt hat (rasche und nahezu vollständige Umsetzung bei Zimmertemperatur). Dabei entsteht ein Tetra-Trimethylsilyl-Derivat (TMS-Derivat, siehe (Abb. 1) ): C18H40O6Si4 ( m = 464 gmol-1 ).

Andere häufig verwendete Silylierungsmittel sind BSA [N,O-bis(Trimethylsilyl)acetamid] und BSTFA (das Trifluor-Analogon zu BSA). Durch Zugabe von Pyridin (wasserfrei!) als ideal geeignetes Lösungsmittel (mit zusätzlicher katalytischer Wirkung) und durch leichte Erwärmung kann die Silylierungsreaktion beschleunigt werden.

Die Dehydroascorbinsäure lässt sich unter diesen Bedingungen jedoch nicht analytisch von der Ascorbinsäure trennen. Beide Spezies eluieren in einem Peak. Eine Möglichkeit zur Trennung ist die Veränderung des Lösungsmittels der Probe (z.B. Aceton, Silylierung in neutraler Lösung), wobei jedoch die Löslichkeit verringert und die Reaktionszeit erheblich verlängert wird.

Trennung und Detektion

Das Trägergas (He, N2) übernimmt den Transport der Probe, die in den Gaschromatographen injiziert wird. Bei ausreichender Säulentemperatur (etwa 200°C) und geeigneter stationärer Phase gelingt eine Abtrennung der Ascorbinsäure von Zuckern oder anderen Probekomponenten (unterschiedlich starke Retention).

Die Detektion erfolgt in den meisten Fällen mit einem Flammenionisationsdetektor (FID). Dabei müssen zur Identifizierung der Substanzen Vergleichsmessungen mit Referenzsubstanzen durchgeführt werden.

Für eine quantitative Auswertung werden die integrierten Peakflächen (in Näherung: Produkt aus Peakhöhe und Halbwertsbreite) herangezogen und das Ergebnis mit den Werten einer Kalibriergerade verglichen. Die Identifizierung der Peaks wird erleichtert, wenn der Gaschromatograph mit einem Massenspektrometer gekoppelt wird.

Beispiel

Massenspektrum des TMS-Derivates der Ascorbinsäure

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