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Tutorial MenueAnalytische AnwendungsbeispieleLerneinheit 5 von 8

Quantitative Bestimmung von Vitamin C

Enzymatische Methode

Enzyme sind biologische Katalysatoren - Proteine mit funktionellen Gruppen, an denen sich die eigentlichen Stoffumsetzungen vollziehen. Die Basis enzymatischer Analysen bilden spezifisch arbeitende Enzyme. Dabei wird die zu analysierende Substanz (Substrat) entweder selbst mittels Enzym umgesetzt oder sie beeinflusst eine enzymkatalysierte Reaktion.

Die Analyse der Ascorbinsäure mithilfe von Enzymen ist wegen ihrer hohen Spezifität und ihre vergleichsweise einfache Durchführung eine häufig verwendete Bestimmungsmethode.

Zur Bestimmung der Ascorbinsäure wird meist das Kupfer-Enzym Ascorbatoxidase (EC 1.10.3.3) herangezogen, weil es die Oxidation der Ascorbinsäure zur Dehydroascorbinsäure spezifisch und effizient katalysiert.

Abb.1
Oxidation der Ascorbinsäure mit Ascorbatoxidase zur Dehydroascorbinsäure

Darüber hinaus kommen bei Vitamin-C-Analysen andere Enzyme wie Peroxidase (EC 1.11.1.7) oder Glutathion-Dehydrogenase (EC 1.8.5.1) zum Einsatz. Das letztgenannte Enzym katalysiert die Reaktion von Dehydroascorbinsäure mit reduziertem Glutathion zu Ascorbinsäure und oxidiertem Glutathion, wobei die gebildete Ascorbinsäure dann photometrisch (bei 265nm) erfasst werden kann.

Probenvorbereitung

Eine Vortrennung des Substrates ist nicht erforderlich, da mit der Wahl des Enzyms die Reaktion spezifisch gestaltet wird.Für die eigentliche (meist photometrische) Messung müssen jedoch Störungen (wie Trübung, CO2-Anwesenheit, hoher Fettgehalt, zu hohe Analytenkonzentration u.ä.) durch geeignete Vorbehandlungen ausgeschlossen werden.

Detektion und Auswertung

Die Gestaltung der enzymatischen Ascorbinsäure-Tests ist in Abhängigkeit von der Matrix, den Laborbedingungen und den Anforderungen an die Genauigkeit sehr unterschiedlich:

  • Polarographische Erfassung des Sauerstoffverbrauches: Einen Nachweis mit hoher Empfindlichkeit stellt die polarographische Erfassung des Sauerstoffverbrauches bei der katalysierten Oxidation dar. Die Probe kann dabei durch eine Säule geleitet werden, auf welche die Ascorbat-Oxidase aufgebracht wurde. Die Nachweisgrenze liegt bei dieser Methode bei 2 bis 3pmol, eine Genauigkeit, die besonders für die Analytik biologischer Proben (mit geringer Ascorbatkonzentration) von Vorteil ist. In der Nahrungsmittelanalytik werden für Reihenuntersuchungen auch Enzymmembranen eingesetzt, die mit einer Sauerstoff-Elektrode gekoppelt sind (Biosensoren) und zur Messung der Ascorbinsäurekonzentration in der Probe verwendet werden.
  • Photometrische Detektion der Reduktion von NAD+: Oft dient bei enzymatischen Reaktionen das System NAD+/NADH (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) als korrespondierendes Substanzpaar zur Wasserstoff-Übertragung (analog das Phosphat NADP).Die reduzierte Form (NADH) zeigt im UV-Spektrum neben der Absorption bei 260nm eine zusätzliche Absorptionsbande mit dem Maximum bei 339nm, deren Extinktionszunahme (bei vorausgesetzt vollständigem Umsatz) ein Maß für die eingesetzte Substratmenge (Ascorbinsäuregehalt der Probe) ist.
  • Kombination enzymatischer und photometrischer Methoden: Die mangelnde Spezifität der photometrischen Nachweise der Ascorbinsäure durch Interferenz vieler gleichfalls reduzierender Substanzen wird ausgeglichen, wenn Parallelbestimmungen mit und ohne Zusatz von Ascorbatoxidase durchgeführt werden. Auf diesem Prinzip beruhen auch verschiedene "Fertigtests" zur Vitamin C-Analyse, die im Handel erhältlich sind. So reagiert Ascorbinsäure neben anderen Reduktionsmitteln beispielsweise mit einem Tetrazoliumsalz unter Bildung eines Farbkomplexes. Führt man die Reaktion unter Anwesenheit von Ascorbatoxidase durch, katalysiert das Enzym (ausschließlich!) die Oxidation der Ascorbinsäure. Da die gebildete Dehydroascorbinsäure nicht reduzierend wirkt, resultiert die dann gemessene Extinktion des Farbkomplexes nur aus der Reaktion der anderen Substanzen in der Probe. Die Differenz der Extinktionswerte beider Messungen ist ein Maß für die Konzentration der Ascorbinsäure in der Probe.

Vorzüge und Grenzen enzymatischer Tests

  • Enzymatische Tests sind in der Regel hochspezifisch (bezogen auf Einzelsubstanz oder Substanzgruppen).
  • Die verwendeten Komponenten sind stabil und damit längere Zeit lagerfähig.
  • Der Verbrauch an Reagenzien und der apparative Aufwand sind gering.
  • Eine einfache Detektion (z.B. Photometer) ist meist möglich.
  • Für Reihenuntersuchungen sind automatisierte Analyseeinheiten verfügbar (großer Probendurchsatz).

Die Bestimmung der Ascorbinsäure mittels Ascorbatoxidase findet aufgrund dieser vielen Vorteile breite Anwendung. Es bestehen jedoch folgende Einschränkungen: Biochemische Analysen können nur in Flüssigkeiten vorgenommen werden (Trägerfunktion für Analyten) und die Proben müssen frei von Stoffen sein, die das biologische System des Tests (zer-)stören!

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