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SequenzanalyseZoomA-Z

Fachgebiet - Biochemie, Analytische Chemie

Mit einer Sequenzanalyse wird die Reihenfolge der Monomeren in einem polymeren Molekül ermittelt. In der Biologie bezieht man den Begriff meist auf die Analyse der beiden wichtigsten Biopolymeren, der Nucleinsäuren und der Proteine.

Zur Sequenzierung von DNA existieren zwei unterschiedliche Methoden. Die Maxam-Gilbert-Methode (auch chemische Sequenzierung genannt) benutzt vier basenspezifische Abbaureaktionen, die man limitiert auf radioaktiv markierte DNA-Moleküle einwirken lässt. Nach elektrophoretischer Auftrennung der entstandenen Abbau-Fragmente lässt sich aus dem Bandenmuster die Sequenz direkt ableiten. Die von F. Sanger entwickelte Didesoxy-Methode (auch enzymatische Sequenzierung oder Kettenabbruch-Methode genannt) basiert auf einer von DNA-Polymerasen katalysierten Synthese eines komplementären DNA-Stranges. Die Synthese wird in getrennten Reaktionsansätzen durch Zugabe entsprechender 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-triphosophate vorzeitig abgebrochen, da nach Einbau eines Didesoxy-Nucleotids keine weitere Kettenverlängerung stattfinden kann. Man erhält nach einer Gelelektrophorse ebenfalls ein Bandenmuster, aus der sich die Sequenz (des komplementären Stranges) ablesen lässt. Die Didesoxy-Methode hat sich zum Standard-Sequenzierverfahren entwickelt, da sie sich mit Hilfe von Fluoreszenz-Farbstoffen sehr gut automatisieren lässt. Auch alle großen Sequenzier-Projekte zur Aufklärung ganzer Genome beruhen auf diesem Verfahren.

RNA wird entweder direkt sequenziert, wobei das Verfahren dem chemischen Abbau nach A. Maxam und W. Gilbert ähnelt, oder zunächst in cDNA umgeschrieben, um dann die Methoden zur DNA-Sequenzierung anwenden zu können.

Die Protein-Sequenzierung zur Bestimmung der Abfolge der Aminosäuren wird nach dem Prinzip des Edman-Abbaus automatisiert in so genannten Protein-Sequenatoren durchgeführt. Dabei wird von dem Protein am N-Terminus beginnend schrittweise eine Aminosäure entfernt und diese nach Derivatisierung chromatographisch über ein HPLC-System identifiziert. Auch mit kleinen Proteinmengen können auf diese Weise Sequenzen von bis zu 50 zusammenhängenden Aminosäuren erhalten werden. Daneben wird seit Anfang der 1990er Jahre auch zunehmend die Sequenzierung von Proteinen und Peptiden mittels Massenspektrometrie eingesetzt. Diese Methode beruht ebenfalls auf dem Edman-Abbau, allerdings werden nicht die einzelnen abgespaltenen Aminosäuren nachgewiesen, sondern die Massen der verkürzten Peptid-Fragmente mittels MALDI-TOF möglichst exakt bestimmt. Mehrfache Abbau-Runden resultieren in verschiedenen Peptid-Fragmenten, die sich jeweils um eine N-terminale Aminosäure unterscheiden, es entsteht also gewissermaßen eine Leiter aus Peptid-Fragmenten (deshalb spricht man auch von Leitersequenzierung). Sind die exakten Massen der entstandenen Fragmente bekannt, lässt sich aus den Massendifferenzen die Aminosäure-Sequenz ermitteln.

Siehe auch: Primärstruktur , Copolymer